重组人干扰素βser-%2717-的制备及其对SARS病毒的抑制作用.pdf 5页VIP

3．重组人干扰素pser盯的制备及其对SAILS病毒的抑制作用 张振龙1刘建源1扬云凯2邓宛明1崔春青1王淑芳1汤燕文。赵建英1 (1北京生物制品研究所北京100024：2北京天坛生物制品股份有限公司北京100024) 制作用进行研究。方法通过发酵收集菌体，经高压匀浆破碎收集包涵体、有机溶剂抽提、酸沉淀、 研制出了rhlFNl7．ser”纯品，为进一步的临床研究奠定了基础。 、(单位她址r讯痿翻璃邗眍=伺谤南里干号北京生物制品研究所中试一室i —孵编}4∞嘎14卜乓啸～“帅}6朝控挎士¨53手卜 关键词：重组人干扰暴《主互=渤SAR，S国状病毒 V ’ 、 ／’。／ 人IFN．口属于l型干扰素，具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用．临床上主要用于多发性 后在大肠杆菌中获得高效表达，其比活性和稳定性大大超过大肠杆菌表达的天然人[FN．13。经过发酵、 研究结果报告如下。 材料与方法 1．材料 G-75层析介质和蛋白质标准均购自 国际标准品由英国NIBSC提供，SephacrylS-200、Sephadex Phamatcia公司，Lowry检测试剂购自SIGMA公司，所用化学试剂均为进口或国产分析纯。 2．工程菌的发酵培养 取冻存菌种划线接种于LB(含50mg／LAmp)琼脂乎扳中，37℃活化过夜，挑选单菌落接种丁-岔 LB的三角瓶中，37C、培养过夜。次日．将种子 LB的试管中．37C培养10h，然后转种至含200ml 养4h，离心收集菌体、称重。 3．菌体破碎与粗提 mmol／L PB溶解后，加入等体积的仲J醇 15min，收集包涵体沉淀，用I％SDS、10mmol／L盯rr、10 -，4_ 进行抽提，4000rpm／min离心10rain，收集上层有机相，用1NHCI调节pH至5．0，然后离心．收集沉 淀．称重，此即为粗制干扰素。 4．rhlFNl3ser”的精纯化 4．1 S-200凝胶装入色谱柱中．去热原后，用 SephacrylS-200层析纯化将保存的Sephaeryl 50ram、pH5．5的醋酸缓冲液平衡，将酸沉淀的溶解液上样，收集洗脱液，通过SDS检测。 4．2 G一75凝胶装入色谱柱中，去热原后，用 SephadexG-75色谱将充分浸泡后的Sephadex 存符合要求的rh[FN-131b部分。 5． rhIFNp∞r”的理化特性分析 5．1干扰素效价测定采用VSV-WISH系统按细胞病变抑制法测定。 5．2 SDS分离胶15％．浓缩胶5％，上样量10pg，考马斯亮蓝R．250染色。 5．3紫外吸收光谱分析扫描波长范围为200～300rtm。 5．4蛋白含量涓定采用Lowry法测定 5．5分子量测定 采用还原型sDS_PAGE 5．6其它分析项目均按中国生物制品规程进行。 6．rhlFNllser”对SARS病毒的抑制试验 采用细胞病变抑制法。用细胞生长液将rhlFNl＆ser”连续4倍稀释至4．”，加入己长成单层的Vero．E6 计算能够抑制50％细胞病变的干扰素浓度(即Ec，o)。 结 果 1．工程苗的发酵培养与产物表达 工程菌经IPTG诱导表达后．与诱导前相比有明显的目的蛋白带表达，见圈l。SDS．PAGE电泳凝 理论值相符，工程菌发酵后的收获量为13．08 g，L培养液。 l 2 3 4 5 图1发酵菌体表达rhlFNl3ser‘7的SDS．PAGE l SDSinE．coli Fig profileofrhlFNl3ser”expressed Lane afterinduced I：beforeindueing：Lane2～4：2、3、4h ．7孓 Lane marker 5：protein 2．rhlFNpserl7的纯化 将所得菌体经高压匀浆破碎后，充分洗涤后制各出干扰索13serl7包涵体，经过有机相抽提、酸化 SephacrylS-200和Sephadex 析表明，其纯度超过95％，见图2。 图2纯化rblFNB,ser”纯化的SDS．PAGE 7 1 SDS Fig ofpurificationofrhlFNpserl Lane1：acid 2：S-200 precipitation：Lanepooledfraction； Lane3：G-75 fraction：Lanemarker pooled 4：protein 3．纯化rhlFN—pser”的鉴定 过2x10 7IU／mg蛋白以上，各项技术指标均与国外同类产品相符，达到』临床用基因工程产品要求，见表 1。 表1 rhIFN．13serl7纯品的鉴定结果 7 Table1 CharacterizationrhlFN一8serl ofpurified 检测项目 测定结果 活性(×107IU／m1) 比活性(×107IU／mg) SDS．PAGE电泳(％) HPLC(％) 分子量(kD) 残余DNA(ng) 残余工程菌蛋白(％) 紫外吸收光谱(nm) 等电点 懈卿螂㈣；耋硼训砌“ -76- Westemblot 单一条带 4．rhIlwpserl7对SARS病毒的抑制作用 6 病毒具有抑制作用．其Ec50为69．38±78．46IU／ml，当rhIFN．Bser”的浓度为274．5±105IU／ml时，能 够完全抑制50TCID∞的SARS病毒。 讨 论 IFN．B和IFN-a一样．属于I型干扰素，结合于同一类型受体，因此具有相似的生物学作用，但 是由于IFN．p的独特理化性质(如疏水性强)等所决定，IFN．p在体内还具有一些不同的生物学特性， 入血液，IFN．B在局部组织的分布优于IFN-a，具有较强的免疫调节作用和抗病毒作用，因此IFN．p具 有更广泛的临床应用价值。我们利用特异性点突变技术将天然人IFN．B的17位的Cys变为Set后在大 肠杆菌中获得高效表达，其比活性和稳定性大大超过大肠杆菌表达的天然人IFN．B。经过发酵和一系列 纯化步骤制备出了符合临床使用要求的rhIFN—Bse，7纯品，为进一步临床应用奠定了基础。 SARS病毒性疾病是一种新型急性传染性疾病。目前尚缺乏特异性治疗药物．因此，需要筛选可 用于该疾病治疗和预防的有效药物，为此我们对IFN．13对SARS病毒的抑制作用进行了研究，初步研 IU／ml， 与国外报道的结果基本一致。美国陆军传染病医学研究所的科学家们在筛选抗非典药物的测试中发现， 105 研究结果证明IFN．13即可用于预防又可用于治疗，是最具潜力的抗SARS药物之一．可以单独或与其 他抗瘸毒药物联台使用。所以rhll附．13ser”的研制成功除用于多发性硬化症、乙犁肝炎、丙型肝炎等疾 病的治疗外，还可能为SARS疾病的预防和治疗提供一条有效途径。 (致谢：rhlFNl3ser”对SARS病毒的抑制作用实验得到军事医学科学院微生物流行病研究所微生 物检验研究中心病毒室领导和科研人员的大力协助，在此表示衷心感谢。) 参考文献 ot for H a1．A of interferon-betaadministration KagawaT,MorizaneT,Saito studylong-termweekly pilot chronic B．AmerJ hepatitis Gastroenter,1993；88(2)：212-214 withhuman Lancet- 2 CinatlJt B．ChandraP，eta1．TreatentofsARS Morgenstem interferons[J]．nIe 2003，362：293-294． DFlu ofhumanfibroblastinterferon 3 Mark SD，CreaseAA，eta1．site-specificmutagenesis gene．Proc ．77- Natl．Acad．Sci．USA．1984；81：5662．5666． 4 Hm a1．A aminoacid in its Shepand leungG．StebbingN，etSingel changeIFN-B，abolishes antiviral antivi吼Nature1981；294：563·565 5 Knobler recombinanthumaninterferon-betatreatment RL，GreensteinJl，JohnsonRP,eta1．Systemic of sclerosis：Pilot and J Interferon relapsing-remittingmultiple studyanalysissix-year-follow-up Res，1993，13：333．337 4．1i-干扰素的特性与临床研究 丽珠集团医学市场总部杨苏河 湖北大学杨扬 本文主要论述13-干扰素的一般特性，p干扰素的主要作用机制，争干扰素的给药途径，以及13-干 扰素的临床应用． ／ r 关键词：p．干扰素i自岳功多发性硬化症∥；非小钽!撕癌?基底细熙癌 。 √ ＼／ 1 、， }干扰素的特性 目前认为干扰素是由特定的诱导物(包括病毒与非病毒)作用下，由细胞基因编码产生的一种或 多种蛋白质，这种蛋白质并非直接作用于病毒，其活性又受另一组细胞基因组的调控，即干扰素作用于 细胞时，又诱生另一类基因产物(AVP)。由于这类基因产物，引起细胞具有广泛的抗病毒活性，抑制 细胞分裂和肿瘤细胞增殖，以及细胞免疫系统功能的活性，这是一个系统，故称为干扰素系统(IFN，)。 干扰素早期是根据特定特体分类，后来依据氨基酸的序列和抗原性不同分类，分为q、p、T三类。 大约也有4种以上的亚型，近年又发现了∞和z两种干扰素，它们与a-干扰素相似I】“。 B．干扰素是由成纤维细胞受病毒感染或干扰素诱生剂所产生的一类具有生物活性的糖蛋白。基因 研究表明，B．干扰素与a．干扰素有80％的序列相同，具有许多