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《生命科学研究》论文修改范例稿 人参皂苷Rg1对丙二醛抑制小鼠间充质干细胞成骨分化的 保护作用 黄思洋1，，1，，李 烨1* ，中国湖南 长沙 410081；2. 湖南省长沙市第一中学 中国湖南 长沙 410005；3. 湖南科技职业学院，中国湖南 长沙 410004) 摘要：人参皂苷Rg1ginsenoside Rg1，GS-Rg1对丙二醛alondialdehyde，MDA制小鼠间充质干细胞esenchymal stem cells，MSCs成骨分化的保护作用机制在MSC成骨诱导培养下，以不同剂量10 mg/L、50 mg/L、100 mg/LGS-Rg1对成骨诱导培养小鼠骨髓MSC预处理24，然后用丙二醛，on Kossa染色茜素红染色检测钙结节形成碱性磷酸酶活性alkaline phosphatase，ALP)活性，利用Q-RT-PCR和Westen-blot检测ALP)和Runt-related transcription factor 2，Runx2)的mRNA及蛋白表达GS-Rg1能够增加钙结节形成及碱性磷酸酶活性，上调ALP和Runx2表达GS-Rg1对MDA羰基应激MSCs的成骨分化具有保护作用。 关键词：人参皂苷Rg1；间充质细胞；丙二醛；成骨分化Q955 文献标识码：A Protective Effect of Ginsenoside Rg1 Against MDA-Suppressed Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells HUANG Si-yang1, CHEN Ji-yao2, WANG Yi-an1, ZHANG Jun3, LI Ye1* (1. College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081，Hunan, ChinaHunan, China; 3.Hunan Vocational College of Science Technology, Changsha 410004, Hunan, China) Abstract: Cytoprotective effects of ginsenoside Rg1 (GS-Rg1) against malondialdehyde (MDA)-suppressed osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells (MSC) and the possible mechanisms were investigated in vitro. After osteogenic differentiation of MSCs was induced by estrogenic medium, MSCs were pretreated with GS-Rg1 at different doses ( 10 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L) for 24 h and then treated with MDA (0.1 mmol/L) for 24 h. During the research, the formation of mineralized nodule and the activity of alkaline phosphatase (ATP) were examined. The mRNAs and protein expression of Runx2 and ALP were analyzed by Q-RT-PCR and Western-blot, respectively. The results showed that pretreatment of GS-Rg1 increased calcium nodule formation and ALP activity, and up-regulated expression of ALP and Runx2, which indicated that GS-Rg1 protected MSCs from MDA-suppressed osteogenic differentiation. The upregulation of ALP and Runx2 by GS-Rg1 may contribute to the protective role in osteogenic differentiation of MSCs. Key words: ginsenoside Rg1 (GS-Rg1); mesenchymal stem cells (MSCs); malondialdehyde (MDA); osteogenesis 骨髓间充质细胞esenchymal stem cells，MSCs)来源于发育早期的中胚层，它们具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能特性[1-3]。MSCs成骨分化的减弱成脂分化的增强是衰老的重要[4-6]，同时也是骨质疏松症发生发展的重要机制[7]活性羰基类物质eactive carbonyl species，RCS)是脂质过氧化和非酶糖基化的共同活性中间产物蛋白质核酸等生物大分子的氨基基团发生羰-氨反应，影响生物分子的活性和功能，进而造成一系列病理生理相关的改变，在多种老年退行性疾病的病理过程中发挥重要的作用[8]丙二醛alondialdehyde，MDA脂质过氧化过程中形成活性羰基化合物，骨髓MSCs发生，与老年性骨质疏松密切相关[9] 我们的前期研究发现，MDAalkaline phosphatase，ALP)和Runt-related transcription factor 2，Runx2)的蛋白表达可以抑制MCSs的成骨分化[10]。 人参三醇类是人参皂苷的主要活性成分之一大量的研究显示GS-Rg1具有抗氧化抗应激、抗衰老以及保护细胞免受毒性物质损伤的作用[11-14]。有研究证实GS-Rg1可以预防绝经后骨质疏松症[15]，但是目前尚未有研究报道GS-Rg1对羰基应激本应用MDA作用于小鼠MSCGS-Rg1对ALP活性和钙结节形成的影响，以及对ALP和Runx2表达老年骨质疏松症等疾病的防治提供实验依据 1　材料与方法 1.1 材料 Balb/c小鼠雌雄不限，34周龄，体重20±1.5 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；1, 1, 3, 3四甲氧基丙烷TMP，Fluka公司美国胎牛血清FCS，Hyclone公司美国L-DMEM培养基Gibco公司美国；TRIzolInvitrogen公司美国Taq man逆转录酶试剂盒和SYBR Green Master MixABI公司美国人参皂苷纯度≥ 98%吉林大学医学部天然药物化学研究室提供碱性磷酸酶ALP)试剂盒南京建成生物制品公司Runx2抗体、抗GAPDH 抗体(武汉博士德生物工程有限公司；Anti-actinSigma公司美国 1.2 溶液的配制 人参皂苷储存液：称取粉剂，用无水乙醇将人参皂苷Rg1溶解，再将溶解有人参皂苷Rg1乙醇溶液逐滴加入DMEM培养液中，使得乙醇浓度达到1.25%，过滤除菌，4 ℃贮存备用。用相应体积DMEM溶液配制成浓度为400 mg/L的人参皂苷储存液。 MDA用酸水解TMP法配置50 mol/L的MDA储备液主要过程：2.5 mmo1/L的TMP与1.0 mol/L的HC1 2.0 mL混合在40 ℃的水浴中振荡水解2.5 min，TMP完全水解后用6.0 mol/L的NaOH调节pH值至7.2，最后用PBS定溶到50 mL，并测定储备液在267 nmε=31 500)的紫外吸收值来确定是否符合要求浓度 1.3 MSC的体外培养 无菌条件下取小鼠双侧股骨，用含10% FCS的DMEM培养液冲洗髓腔，冲出骨髓细胞，获得骨髓单细胞悬液。将骨髓细胞种于含10% FCS的DMEM培养液中，接种密度为每mm2 5×106个骨髓有核细胞培养瓶底，于37 ℃、10% CO2、饱和湿度下培养箱中孵育，每3更换培养液一次细胞增殖至铺满瓶底时，用胰蛋白酶消化法收集贴壁细胞, 于同样培养体系和条件下传代培养, 以扩增和纯化骨髓MSCs。P3代的MSCs，当细胞生长达到7080%融合状态时，吸去孔内上清培养液，换入成骨诱导分化培养基，培养体系为DMEM、10% FCS、0. 1 mol /L地塞米松、50 mol/L抗坏血酸磷酸盐、10 mmol /L β-磷酸甘油。 1. 实验分为5组：1) 空白对照组(Control)；2) MDA处理组：在培养基中加入终浓度为 0.1mmol/L的MDA孵育24 h；3) GS-Rg1低剂量组(L)：在培养基中先加入终浓度为10 mg/L的GS-Rg1预处理24 h，再加MDA处理；4) GS-Rg1中剂量组(M)：在培养基中先加入终浓度为50 mg/L的GS-Rg1预处理24 h，再加MDA处理；5) GS-Rg1高剂量组(H)：在培养基中先加入终浓度为100 mg/L的GS-Rg1预处理24 h，再加MDA处理。实验重复3次。 1.5 Von Kossa染色 用无磷酸钙的PBS冲洗细胞后，以40 g/L的多聚甲醛室温固定30 min，加入50 g/L AgNO3溶液 1.6 ARS染色　 成骨诱导21时终止培养，弃上清培养液PBS洗3遍700 mL /L冰乙醇固定细胞10，水洗3遍，0.1%ARS-Tris-HCl染液pH 4.2)室温染色30再用PBS冲洗15 min以洗脱非特异性染色, ARS染色法检测钙沉积ARS定量分析时, 室温用100 g/L cetylpyridinium chlorideCPC)孵育15 min, 溶解下来的染料通过测定A570 nm值定量 1.7 ALP活性 各组经诱导培养后清培养液，PBS洗涤细胞3遍，每孔加入50 μL 0.1% ALP检测试剂工作液每孔100 μL，37 ℃孵育30 min，加入0.2 mmol/L NaOH ，每孔50 μL终止反应，酶标仪上测定A490nm值。 1. 8 RNA提取以及实时荧光定量PCR 各组经诱导培养后zol试剂说明书。aq man 试剂盒2 μg RNA逆转录成cDNA PCR反应条件95 ℃ 45 s，94 ℃45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。按照SYBR Green Master Mix试剂盒说明书操作，检测ALP和Runx2β-actin作内对照标化，用△△Ct法定量分析。Genank上查找小鼠、Runx2β-actin (内参)的mRNA序列使用Primer Premier 5.0设计引物由上海生工合成。PCR引物序列见表1 表1 荧光定量 PCR 引物序列 Primer Sequence ALP Sense: 5′ AACCCAGACACAAGCATTCC 3′ Antisense: 5′CCAGCAAGAAGAAGCCTTTG 3′ Runx2 Sense: 5′ CCACCACTCACTACCACACG 3′ Antisense: 5′TCAGCGTCAACACCATCATT 3′ β-actin Sense: 5 CTGGCACCACACCTTCTACA3 Antisense: 5 GGTACGACCAGAGGCATACA3 Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR analysis 1.9 Western印迹分析 用冷PBS洗涤细胞，加细胞裂解液，迅速将细胞刮下冰浴条件下超声破碎细胞，离心后上清液，用Bradford法测定蛋白质浓度取蛋白质样品25 μg)，加等体积上样缓冲液，100 ℃10%SDS电泳后电转移至PVDF膜上，封闭液室温封闭1 h，1∶1 000孵育一抗4 ℃过夜，二抗1∶2 000)，室温孵育1 h，ECL发光显影使用软件Bio-Rad Quantity One对目的条带用β表示各组MSC的ALP和Runx2/Cbfa1相对表 1.10 统计学处理 所有数据用平均值±标准差(x± s)表示多组间比较，采用方差分析；显著性水平为 0.05。Sigma Plot计算机软件作图 2 结果 2.1 GS-Rg1促钙结节 为了研究GS-Rg1对于钙结节形成的影响，在成骨分化诱导培养的P3小鼠MSCs中用不同浓度的GS-Rg1 (10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)孵育24 h，再用100 μmol/L MDA处理，然后继续成骨分化诱导培养21 d，经ARS染色、Von Kossa染色，显微镜观察钙结节的生成情况。通过对成骨分化空白对照组、MDA处理组、GS-Rg1预处理组进行钙结节染色(图1)及计数(图2)，发现与MDA处理组相比，中高浓度(50 mg/L和100 mg/L)的GS-Rg1预处理显著增加钙结节数量(P0.05)，但是低浓度(10 mg/L) GS-Rg1预处理对钙结节数无显著性影响(P0.05)。 图1 GS-Rg1对MSC成骨分化的影响 ARS染色 von Kossa染色GS-Rg1预处理(标尺20 μm)。 Fig.1 Effect of GS-Rg1 on oteogenic dfferentiation of MSCs (A) von Kossa staining; (B) ARS staining. 1: the control group; 2: MDA-treated group; 3: 50 mg/L GS-Rg1-treated group (scale bar: 20 μm). 图2 GS-Rg1对 ##：P＜ Fig.2 Effect of GS-Rg1 on number of mineralized nodules in MSC cultures ##: P0.01, compared with control group; *: P0.05, compared with MDA-treated group; **: P0.01, compared with MDA-treated group. Same with the following Fig.3-6. 进一步对ARS染色结果开展定量分析，用CPC溶解测定A570 nm值。如图3所示，与对照组相比，吸光值明显降低P0.01)；与相比，10 mg/L、50 mg/L和100 mg/L种不同浓度的GS-Rg1预处理能够增加其吸光值P0.05)，GS-Rg1对MDA抑制钙结节形成具有保护作用。 图 GS-Rg1对染色 Fig.3 Effect of GS-Rg1 on absorbance values in ARS staining test 2.2 GS-Rg1促进ALP活性 各组经诱导培养后A490 nm值(图4)。与相比，低浓度10 mg/L) GS-Rg1的吸光值无显著性差异(P 0.05)；而中高浓度(50 mg/L和100 mg/L) GS-Rg1预处理组可明显增加吸光值，提高碱性磷酸酶活性(P0.05)高浓度Rg1 (100 mg/L)比中浓度Rg1 (50 mg/L)的效果更加明显， 图4 Rg1对ALP 活性的影响 Fig.4 Effect of GS-Rg1on ALP activity in MSC cultures 2.3 GS-Rg1促进ALP的表达 与相比，个浓度Rg1均可增加ALP mRNA表达水平(P0.05)50 mg/L GS-Rg1预处理100 mg/L和50 mg/LRg1预处理增加ALP表达水平，差异均有显著性意义(P0.05)。 图5 GS-Rg1 对 ALP mRNA和蛋白表达的影响 Fig. 5 Effect of GS-Rg1 on ALP mRNA and protein expression 2.4 GS-Rg1促进Runx2的表达 与相比，高、中浓度(100 mg/L和50 mg/L)Rg1预处理明显Runx2 的mRNA及蛋白表达水平，差异均有显著性意义(P0.05)低浓度(10 mg/L)Rg1预处理Runx2 mRNA的表达水平显著性(P0.05)见图6。 6 GS-Rg1 对 Runx2 mRNA和蛋白表达的影响 Fig. 6 Effect of GS-Rg1 on relative level of Runx2 mRNA and protein expression 3 讨论 ALP和Runx2mRNA及蛋白的表达GS-Rg1预处理能够促进MSC成骨分化相关基因ALP和Runx2mRNA及蛋白的表达，染色及其定量分析结果结果，GS-Rg1能够促进钙结节的形成拮抗MDA引起的MSC成骨能力降低对所引起的MSC分化能力具有保护作用 已有研究报道，人参成分具有防治骨质疏松的Gong等[15]发现，Rg1治疗能够缓解卵巢切除模型大鼠骨质疏松症状林天明等[16]报道，23例绝经后骨质疏松伴贫血倾向的患者服用人参养荣汤，贫血和骨质疏松人参皂苷具有明显的抗氧化应激作用，[17]，GS-Rg2通过增加DNA修复，降低紫外线诱导NIH3T3细胞损伤[18]。 MSCs成骨分化与骨组织稳态维持和再生修复密切相关，MSCs细胞衰老MSCs成骨分化[4-6]。MSCs数量上的减少，增殖和成骨分化能力降低，是老年骨质疏松症发病机制重要环节[19]是成骨细胞分化的早期标志, 和成骨细胞的成熟密切相关, 其活性的高低可以反映细胞的成骨分化能力Runx2被认为是骨发育和细胞成骨分化的关键转录因子[20]，Runx2参与了多种信号转导途径，在成骨细胞分化的多种信号途径中起中心作用。 我们研究发现通和Runx2抑制成骨分化[10]Rg1可通过增强ALP和Runx2对于MDA羰基应激引起的MSC成骨分化能力降低具有明显保护作用绝大多数人参皂苷的苷元骨架为四反式环甾体，类固醇激素受体，包括糖皮质激素受体、雌激素受体等Rg1可通过雌激素反应元件的激活，发挥其类雌激素样效应，其效果与雌激素相似，但没有刺激子宫等副作用。因此，我们认为GS-Rg1通过增加ALP和Runx2皂苷具有潜在的应用前景 参考文献(References) Williams A R, Hare J M. 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