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活m养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 刖 吾 月lJ 吾 慢性肾功能衰竭(cRF)是直接威胁患者生命及生活质量的疾病之一，迄今其确 切的发病机制尚未完全明了，以往认为肾功能减退是由于肾小球病变所致，然而 interstitial 近年的研究显示，肾小管问质病变(tubular lesion，TIL)与慢性肾功能 衰竭的进展关系更密切。在TIL中，致纤维化的细胞因子表达上调，其中转化生 factor 长因子131(transforminggrowth 13J TGF—B1)是参与肾小管问质纤维化发 病机制的关键性细胞因子之一。因此研究TGF一13 1和肾间质纤维化之间的关系， 以及研究如何对抗TGF．13 t的作用，达到延缓肾功能衰竭进展的目的，是今后值 得探讨的课题。 1．TGF．B l的生物学特性 TGF—B l超家族共有25个成员，在哺乳动物中为TGF一131_3，以TGF．13前体蛋 白复合物方式分泌。人体内几乎所有细胞均可产生TGF—B，分“活性TGF．13” 和“潜活前体”，后者氨基端有“潜活相关肽”(LAP)，体内有多种因素可切除LAP 而形成分子量为25kD的同源二聚体：“活性TGF．B”。各异构体分布有一定组织 特异性，在肾脏，TGF．13 l表达得最多，且主要在小管上皮细胞和肾小球。TGF— Bl最初是从人血小板、人胎盘和牛肾脏分离出来的。体内已发现5种TGF．B受 体，I、II两型受体的胞质区段有丝苏氨酸激酶活性，与受体后细胞内通讯有关， III型受体分膜结合型和游离型，前者无信号传导活性，但能增加TGF．B与II型受 体的亲和力；而后者则能结合并能阻止TGF．B与靶位结合，从而干扰了TGF一13 的生物学活性。Ⅳ、V型受体作用尚不明。受体后第二信使通路可能与Smad家族 成员有关，后者磷酸化后从胞浆转移至核内而发挥作用。TGF．13的生物学活性非 常广泛，是近年来发现的一个重要的生长因子家族，是各种纤维化疾病的最后共 同因素。TGF．13 l通过受体信号传递发挥以下生物学作用：(1)促进细胞肥大。TGF一 8能阻止细胞从Gl期过渡到S期，而RNA、蛋白质合成增加，表现为增殖受抑细 胞肥大。(2)提高细胞外基质(ECM)含量，包括3方面作用：促进多种ECM成分 如I、IⅡ、Ⅳ型胶原和多种蛋白多糖的合成；抑制ECM的降解，既抑制降解ECM 成分的酶类的合成，如胶原酶、纤溶酶原激活因子，又促进诸如纤溶酶原激活物 抑制因子(PAI)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)等蛋白酶抑制因子的表达j促进 活血养|；|j方延缓慢性肾功能衰竭进展的分了生物学机制研究 前言 整合素表达而增强细胞一基质相互作用。(3)其他作用：损伤修复、胚胎发育、免疫 调节及肿瘤发生等等。 2．TGF．0与结缔组织生长因子(CTGF)的关系 TGF一13可诱导多种细胞分泌CTFG，反过来，CTGF又可作用于相关细胞， 参与TGF-B对这些细胞的促增生和ECM合成作用。应用特异性抗CTGF抗体或 CTGF反义寡核苷酸探针，可有效抑制TGF一13诱导成纤维细胞增生和胶原合成， 域162—128bp处有一个TGF—B反应元件【3】，此元件不存在于其他即可早期基因 家族成员的启动子中，提示TGF．B诱导CTGF表达具有特异性。总之，众多试验 结果表明，TGF—B的生物学作用确实与CTGF有关。但前者作用广泛，除能诱 导细胞增生和促进组织纤维化外，尚有抗炎和抗细胞分化等功能；CTGF作用相对 单一，因此它可能仅介导TGF B的部分生物学效应，主要是在刺激细胞增生和 ECM合成，即促进组织器官纤维化方面起重要作用。 3．肾间质纤维化 肾间质纤维化的病因包括：炎症(感染、原发性间质性肾炎、肾小球肾炎)、各 种损伤(血管、梗阻、放射)、药物、糖尿病和遗传因素等。原始刺激的持续存在(如 糖尿病)，致炎症一瘢痕恶性循环；原始。肾小球损伤导致一定程度的肾功能丧失， 从而引起一系列的肾脏适应性改变。在适应性改变过程中，“残存”肾组织必须增 强其细胞功能以维持肾脏功能在基础水平，但可引起继发性损伤。这种适应性包 括肾小球毛细血管的血流动力学的改变，但最终导致肾小球硬化；因肾小球病变 影响小血管致间质缺血、低氧，继而引起问质损害。起始肾小球损害引起小管间 质的损害，而小管间质的因素又不可避免地进展，导致肾小球的功能进一步降低， 并造成小管间质的进一步损害，如此循环，最终肾小球疾病进展至慢性过程。随 着人们对肾间质纤维化认识程度的加深，认为肾间质纤维化又是一个独立于病因 之外的进展过程。Eddy“1根据其研究结果提出纤维化是由于基质蛋白合成增加和 基质降解受抑制的综合结果；致纤维化的细胞因子，尤其TGF．B1表达上调；单 核，巨噬细胞系浸润间质，它们可能是TGF。B 1的主要来源。 细胞外基质的作用 ECM在肾间质的过度沉积是引起间质纤维化的主要原 因，在肾间质中成纤维细胞、肾小管上皮细胞和血管内皮细胞等细胞均能够合成 活血养liI{方延缓慢性肾功能衰竭进展的分予生物学机制研究 前言 和分泌细胞外基质(ECM)。细胞凋亡在肾间质纤维化中也起重要作用，细胞凋亡在 调节机体生长发育、组织器官的增殖和分化中起重要作用。张国强等[1l】在体外培 养成纤维细胞发现，来自肾问质纤维化肾脏的成纤维细胞增殖过度、分化异常及 凋亡减少。 细胞因子和生长因子的作用 由于肾小管和肾间质在解剖及功能上的密切关 系，肾小管损伤和肾间质纤维化总是伴同或先后发生。损伤的肾小管上皮细胞产 生的多种细胞因子通过肾间质成纤维细胞、肾血管及肾间质炎症细胞的作用，在 肾问质纤维化中起重要介导作用。其中研究较多的是TGF．13。在肾脏纤维化过程 的早期，可以观察到肾间质区存在一种表达骨架蛋白——a一平滑肌肌动蛋白的细 胞，称为成肌纤维细胞，这类细胞是肾间质细胞外基质的主要来源，其数量的多 少与间质纤维化轻重程度密切相关【5】。在有TGF．B存在时，成肌纤维细胞的数量 增多，细胞外基质合成也增多。促使了肾间质纤维化。肾小管间质病变导致肾功 能受损的主要机制：间质纤维化使小管间毛细血管狭窄，血管阻力增加，致肾小 球血流量下降；肾小管，特别是近端肾小管萎缩必然损伤肾小管功能，如肾小球 滤过率(GFR)。已证实除微小病变型外，在所有其他不同类型。肾炎中肾小管间质 与GFR间有高度的相关性；肾小管间质病变直接引起肾小球硬化或纤维化新月体 病变。 4．TGF一13与肾问质纤维化 在小管间质纤维化过程中，人们曾观察到有小管基底膜的增厚，小管间质的 ECM的扩增和间质成纤维细胞明显增多。TGF—B l在致肾间质纤维化过程中发挥 重要作用。在正常肾脏内仅有微量的TGF—B l表达，而在肾脏疾病中显著增加。 TGF B1可通过至少3个环节引起ECM的过度积聚：(1)刺激肾小球细胞ECM成 受体的表达以促进细胞的粘附。 肾脏TGF一13 I主要来源：TGF．13的增加可能主要来源于肾间质细胞和少量的 小管细胞。目前，阳性TGF一13 1间质细胞的性质尚未明确，许多研究实验模型中 产生TGF一13的主要细胞为肾间质的成纤维细胞和肌成纤维细胞【6】。Eddy等研究认 为间质巨噬细胞也是TGF．Bl的重要来源。 TGF一8在肾间质纤维化中的作用：各国学者在实验动物模型和人类慢性肾小 球疾病中发现肌成纤维细胞与肾间质纤维化的形成和发展关系密切，其标志蛋白 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 前言 a一平滑肌肌动蛋白(n—SMA)被认为可作为判断多种慢性进展性肾病预后的指 标。在肾脏疾病进展中，TGF．Bl表达上调。实验动物和人类肾小球疾病中均发现， TGF—B l促进肌成纤维细胞n—SMA的表达171。体外细胞培养试验证实TGF—Bl可 使成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，诱导a．SMA的表达f引。Fan等用体外培养的 方法证实TGF．Bl可促进大鼠肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化，从头表达 a．SMA，且作用呈剂量依赖性【9J。加入TGF—B l抗体，可完全阻断此作用，提示 TGF—B I在上皮一肌成纤维细胞转分化过程中起重要作用。d—SMA阳性的肌成 纤维细胞有比正常成纤维细胞更强的合成和分泌ECM的能力，并能抑制其降解， 促使ECM在肾间质中积聚，导致肾间质纤维化。，国外学者【lo】研究发现肌成纤维 细胞在肾间质纤维化中的作用不仅与其合成ECM有关，也与其收缩引起胶原纤维 重排有关，导致。肾脏瘢痕形成。 在一些刺激因子(如蛋白尿，高血压，高血糖)作用下，肾脏内TGF—B，的 表达可显著增加。在高血压所致的肾间质纤维化过程中，许辉等通过动物实验川1 已充分证明是肾脏局部的RAS系统激活刺激了TGF．B l的产生，AngII是致纤维 化的因子，因此AngII．TGF-Bl—ECM轴在肾脏纤维化中起着重要作用。长期高血 压可同时激活肾脏内皮细胞的RAS系统和TGF—B l，激活的RAS使肾素和AngII 产生增多，后者又进一步刺激了TGF—B l产生，最后导致肾间质纤维化，说明在 高血压肾间质纤维化中AngII-TGF—B1．ECM轴同样起着重要作用。其结果还显示： 血管紧张素转化酶抑制剂能有效降低血压，改善肾脏功能，还能抑制TGF—B lmRNA表达，显著减少了TGF．Bl在肾脏间质中的沉积，减轻了肾间质纤维化。 张帆等通过实验发现原发性肾病综合征患者尿中TGF．B l明显升高，其升高与尿 中24h尿蛋白排泄量呈明显正相关，由此提示大量蛋白尿激活肾脏固有细胞作用 于病损肾组织中的单核巨噬细胞等炎症细胞，导致肾组织中TGF．B l的大量合成 为其纤维化发生机制。为防止原发性肾病综合征患者的。肾脏纤维化，应尽早控制 尿蛋白。李伟民等研究提示， 糖尿病肾病患者中，由于血糖升高导致血管紧张素 II、内皮素、血栓素及血小板衍生生长因子等局部活性因子增多，通过蛋白激酶C 果联系呢?加入外源性TGF—B l可使细胞内蛋白含量和总蛋白合成率增加，TGF． B抗体可阻断该效应，从而证实正是TGF．B l介导了高糖所致的细胞肥大和ECM 合成增加，从而导致肾间质纤维化。此外，TGF—B。对单核／巨噬细胞有趋化作用， 活J6【养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 前言 可促进细胞因子(如ILl、IL6、TNFa、FGF等)分泌，进一步促进ECM合成。甲 状旁腺素(PTH)促进肾脏系膜细胞TGF．B合成分泌。在慢性肾脏病的早期，多数 患者的血清PTH水平已显著提高，PTH能呈浓度依赖和时间依赖地促进系膜细胞合 成分泌TGF．B，从而促使继发甲旁亢的慢性肾病患者的残余肾功能进一步减退。¨21 TGF．B与肾小球硬化的关系：TGF．B已被确定为肾脏疾病中肾小球硬化的关 键介质。起始肾小球损害引起小管间质的损害，而小管间质的因素有不可避免地 进展，导致肾小球的功能进一步降低，并造成小管间质的进一步损害，如此循环， 最终肾小球疾病进展致慢性过程。在TGF—B的作用下，肾小球固有细胞大量合成 纤维黏连蛋白，I、m型胶原，和一些只在损伤时才出现的基质分子。同时，TGF． B诱导一些整合素受体在肾小球细胞表面的表达，一旦损伤持续存在，TGF．B将 持续表达，使细胞外基质过度沉积，导致慢性肾间质纤维化和肾小球硬化。 5．通过调控TGF-B 1治疗肾脏病的前景 不论何因以进行性纤维化为特征的肾脏病，TGF．B常是导致纤维化最后的共 同的中介物，因此对抗TGF-B的作用以阻止肾脏纤维化的进展具有重要意义。目 前国内外对TGF-B的生物学特性、来源、分布及其致肾纤维化的机制研究较多， 应用何种药物更有效地抑制TGF—B致肾纤维化的作用，延缓肾衰进程仍是研究的 热点问题。用TGF-B1抗血清中和TGF—B 1作用，可降低大鼠抗Thy．1肾炎模型 的ECM过多沉积，而不影响正常的修复过程。但抗血清有血清毒作用。限制了其 l临床应用。TGF．B 1并阻止 l天然抑制剂一饰胶蛋白多糖(decorin)可结合TGF．B 其生物学活性，使炎症减轻，ECM沉积减少，且无毒性作用。deeorin为分泌性蛋 白，用基因转染技术，将decorin mRNA eDNA表达载体转染骨骼肌，其decofin 1mRNA、 及蛋白水平表达增加，大鼠肾脏也检测到免疫活性decorin，其TGF．B 蛋白水平下降，病变的肾小球ECM沉积显著降低113]。血管紧张素转换酶抑制剂 和血管紧张素II受体拮抗剂能阻断血管紧张素II诱导的TGF—Bl高表达而干扰肾 脏纤维化，起到保护肾脏作用。大黄、黄芪能抑制TGF．B1的表达。在糖尿病肾 病大鼠TGF—B l可以通过作用于GLUTl增加系膜细胞糖的摄入，从而触发细胞内 糖代谢异常及随后的细胞肥大、ECM积聚。大黄酸具有明显拮抗TGF—B增加系膜 细胞糖摄入的作用，同时系膜细胞GLUTltuRNA的表达也明显下降【141。黄芪多糖 治疗9周后，糖尿病大鼠肾组织内TGF—B蛋白含量及其mRNA的过度表达均有明 显下调，同时其’肾脏肥大，肾小球高滤过状态及尿蛋白排出增加等情况均有不同 活m养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 前言 程度的减轻【l 重1万单位庆大霉素加生理盐水2ml混匀注入腹腔，每隔4d注射一次所制成的弥 漫性增生性肾炎模型中，环磷酰胺与强的松合用对TGF．B的表达有明显抑制作用 并使尿蛋白，尿13 2mG下降，血肌酐、尿素氮也有下降趋势，中药川芎和赤小豆、 6】。 苡仁、鳖甲组成的复方对TGF．13也有抑制作用【l TGF一13是一个大家族，多功能，多向调节的细胞因子，抑制TGF．13的表达作 1、 用对治疗肾间质纤维化有益。本课题通过观察不同时期慢性肾衰患者尿TGF一13 Scr、BUN、Ccr、的变化，为慢性肾衰患者寻找敏感的诊断指标和疗效评定标准。 通过研究中药养阴活血方对血、尿TGF．13和肾功能的的影响，发掘祖国医学宝库 中治疗慢性肾衰的有效方药，以达到延长病人生命，减轻病人经济负担，提高病 人生活质量的目的。 6 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 第一部分 第一部分慢性肾功能衰竭患者 尿转化生长因子B。的检测及临床意义 转化生长因子p(TGF—p)是一种调节细胞生长和分化的多肽。TGF．13有多种 异构体，在肾脏多表达TGF．13。。在一些刺激因子(如蛋白尿，高血压，高血糖) 作用下，肾脏内TGF．131的表达可显著增加，促进细胞增殖和细胞外基质(ECM)过 度沉积。TGF．131可通过以下3个环节引起ECM的过度沉积：①刺激肾小球细胞 ECM成分的合成；②抑制多种ECM蛋白降解酶的活力以抑制ECM的降解；③增 加ECM受体表达以促进细胞的黏附1171若病变持续进展，将导致以ECM沉积为 特征的肾小管间质纤维化和肾小球硬化，临床表现为慢性。肾功能衰竭(CRF)。我 能衰竭时的变化规律、作用及意义。 材料和方法 一、研究对象 均符合CRF诊断和分期标准11810 行透析治疗的CRF患者，纠正引起肾功能损害加重的可逆性因素，病情稳定后再 痛风性。肾病4例，慢性肾小球肾炎26例，狼疮性肾炎12例，糖尿病肾病7例， 多囊肾2例，高血压肾小动脉硬化症9例。各期患者年龄、性别及原发病均具可 比性。另选性别、年龄相匹配健康查体者16例作为对照组，其中男7例，女9例， 年龄16--74(47．33：￡15．78)岁。 二、试剂与仪器 1．试剂：人转化生长因子定量EIA试剂盒，由上海西唐生物科技有限公司提 7 活眦养|；I{方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 第一部分 供。 2．主要仪器：美国产BIO—RAD550型酶联免疫检测仪 三、实验方法 1．收集受试者24小时尿液，混匀，留取4 上清液，～20℃冰箱保存备用。尿TGF—B采用双抗体夹心酶联免疫法(ELASA)， 采用美国BIORAD550型酶联免疫检测仪测定。严格按说明书进行操作。步骤如 下： (1)加入100ul尿标本和预先配制的标准液于Eppendorf管中。 (2)加入100u12．5N酸化溶液。 (3)充分混合后，室温静止10分钟。 (4)加入100u12—7N中和溶液，中和标本后pH值应在7．2—7．6之间。 (5)加200ul标本和标准液于微量滴定孔中，室温孵育3小时。 (6)每孔加入冲洗液400pl，洗涤3次。 (7)加入200ulTGF．13抗体结合物，室温孵育1．5小时。 (8)每孔加入冲洗液400ul，洗涤3次。 (9)加入200ul酶复合物，避光，室温孵育20分钟。 (10)力1入50ul终止液。 (11)30分钟内，于酶标仪上测定吸光度，波长570nm。根据标准曲线回归方程 得出TGF．13浓度，用尿肌配浓度校正。 2．血清肌酐、尿素氮由美国Beckman公司Cx3全自动生化分析仪检测，根据 。0．85)。 3．统计学处理采用SPSSll．5统计软件，计量资料用均数士标准差表示，数据 采用t检验和直线相关分析，P0．05有统计学意义。 结果 一、各期患者的肾功能与对照组比较存在显著性差异，CRF患者Scr、BUN 逐期呈阶梯性攀升，Ccr呈递减性下降。60例CRF患者尿TGF—B1均显著高于对照 活Jf儿养阴方延缓慢性肾功能衰竭进胜的分了生物学gtN研究 第一部分 O．38、--0．47，P均O．01)。 三、尿TGF．8l与Scr的关系如图所示 CRF患者尿TGF—B与Scr的关系 1000 —800 -d 600 3400 ”200 O 0 2 3 4 5 6 TGF—B(ug／L) 表1对照组与各期CRF患者尿TGF—D l、Scr、BUN及Ccr测定值(；±J) 讨论 CRF是各种肾脏疾病发展的最终结局。导致慢性。肾衰的常见病因依次为慢性’肾 9 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 第一部分 小球肾炎、间质性肾炎、高血压和糖尿病肾病。尽管不同的肾脏疾病发展成慢性 肾衰的机制不尽相同，但是，肾损害发展到CRF阶段则表现出相似的病理改变， 主要为肾问质纤维化和肾小球硬化，其组织学特征是成纤维细胞的大量增多及主 要由其分泌的细胞外基质(ECM)的大量堆积。目前认为TGF—BJ是诱发纤维细胞 产生胶原、纤维连接蛋白和糖蛋白的最强因子，且参与肾间质纤维化的各个细节‘1910 哺乳动物中，最初合成的TGF．B是以无活性的前体蛋白形式分泌的【17】。TGF潜在 复合体可被酸、碱、加热而激活。“活性TGF”为二硫键相连的分子量为25kd的同 源二聚体。各种异构体在许多生物反应中表现出相似的作用，其中TGF．昏l最为重 要。人体各种正常的组织都能分离到TGF—pI。体内已发现5种TGF．p受体，几乎 所有的正常细胞表面都有TGF．p受体。TGF—p异构体的分布有一定的组织特异性。 在。肾脏，TGF．81表达最多，且主要分布在肾小管上皮细胞和肾小球。在正常肾脏 重要决定因素，细胞培养、动物实验和人类肾病都证实，TGF．pmRNA和蛋白质的 表达在以ECM积聚为特征的人类肾脏病中显著增加【20】。TGF．BI在调节细胞增殖 和ECM的产生过程中起着关键的作用。给予正常大鼠重组的TGF．6l，会导致肾 间质纤维化的增加12”。为了证明TGF—Bl的致肾间质纤维化作用，Lsaka等用转染 技术，在转染TGF．pl基因三天后的大鼠肾脏内便发现了TGF．B1。同时还观察到转 染TGF．B1基因的大鼠ECM的过度扩张和系膜细胞的增殖。Lsaka等认为：不管是 什么原因引起TGF—Bl增加，甚至可能在没有物理作用和免疫损害等因素的参与下， TGF．pl的过度表达便可能造成肾间质纤维化12“。细胞培养的研究也表明，TGF．pl 促进肾小管上皮细胞的肥大，调节肾脏ECM成分的产生【20】。Border等用急性系膜 增殖性肾炎的动物模型研究显示：肾小球肾炎与TGF．Bl产生和活性的增加有关， TGF诱导了ECM的产生。他们给予诱导的肾小球疾病抗TGF．Bl血清，抑制了ECM 产生的增加，明显地减轻了疾病的组织学变化。以上研究的结果为TGF．BI在引起 肾小球疾病的发病机理中的作用提供了直接的证据，表明了TGF—Bl可能是致肾间 质纤维化的关键性因素。在己病变的肾脏内，TGF—Bl至少通过三种途径促进基质 的积聚：促进多种ECM成分如I、H、皿、IY、V型胶原和多种蛋白多糖的合成； 抑制ECM的降解：既抑制降解ECM成分的酶类，如胶原酶等的合成，又促进如 纤溶酶原激活物抑制因子和金属蛋白酶组织抑制因子等的表达；促进整合素 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 第一部分 J致纤维化 (integrin)的表达，进一步促进了基质的积聚。近年来研究表明，TGF．p tissue factor，cTGF)介导的。 作用可能是由结缔组织生长因子(connectivegrowth CTGF是被TGF．13激活后由成纤维细胞合成和分泌的富含半胱氨酸的多肽，TGF．13 的表达是目前已知唯一的CTGF诱导因素【2引。在动物实验中证实，分别注射TGF．13l 和CTGF可暂时形成肉芽组织，同时给予TGF．B】和CTGF可引起持续的组织纤维 化[241。给予特异性抗CTGF抗体，可有效地阻断正常大鼠肾脏TGF．13诱导的胶原 合成则。对CTGF的研究丰富了TGF．13致纤维化作用的机制。肾脏细胞是尿中 以下生物学作用：①促进细胞肥大，抑制大多数细胞的增殖，但促进某些间质细 胞的增殖；②促进细胞外基质合成；③通过抑制T／B细胞的增殖而抑制炎症反应。 尿中的TGF．13I是肾脏固有细胞通过自分泌和旁分泌产生的，而不受血清中 TGF．pl的影响。为了研究是否通过肾小球基底膜超滤过的血清TGF．pl影响肾病患 糖尿病病人尿中TGF．13l的分泌比正常对照组高，在严重肾损害和系膜扩张的病人 球肾炎病人(其中10例局灶性肾小球硬化，5例膜性肾小球肾炎)尿TGF．131活性， 发现与正常组相比，局灶性肾小球硬化组和膜性肾小球肾炎组尿中TGF．13l是增高 的。Dominguez等还发现在局灶性肾小球硬化组，尿中TGF—Bl水平与血肌酐水平 相关，他们认为TGF．p1的活性可能与疾病的进展相关。TGF—pl亦为其它组织纤维 化标志物。因此血清TGF．13l对肾小球硬化及问质纤维化的诊断缺乏特异性。这些 结果说明，通过肾小球基底膜的血清的TGF—p1的多少对尿TGF．pl的水平几乎没 有影响，尿的TGF．13l来源于肾脏局部产生的TGF一13l。 本研究结果表明，各期CRF患者尿TGF．B1显著高于正常人，在cRF—I、 的一个敏感性指标。但是，Ⅳ期CRF患者尿TGF—Bl呈下降趋势，与BUN、Scr 呈分离现象。此现象可能与肾组织严重纤维化，疤痕形成反而导致TGF合成和分 泌减少有关。 活m养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 第一部分 成分的增加、肾纤维化和肾损害程度相平行。虽然原发性或继发性肾脏疾病的发 病机制不尽相同，但是发展为CRF时，其组织学的改变都是肾小球硬化、肾间质 纤维化和肾小管萎缩。过多表达是其共同的致病因素。酶联免疫吸附实验(ELISA) 检测尿中TGF．13I的含量是一种非创伤性的检测手段，有助于评价CRF的发生发展 和肾脏纤维化水平。对CRF的早期诊断具有指导意义，在CRF治疗方面，可通过 抑制TGF的合成和分泌来延缓CI江的发展。 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分了生物学机制研究 第二部分 第二部分养阴活血方对慢性肾功能衰竭患者血、 尿转化生长因子B。及肾功能的影响 renal 慢性肾功能衰竭(chronicfaileure，cRF)是各种原发性和继发性肾脏疾病 持续性进展的共同归宿，直接威胁患者的生命。近年的研究表明，肾小管间质病 变(tIlbIllarinterstitial TIL中，致纤维化的细胞因子表达上调，其中转化生长因子13l(transforminggrowth factor plTGF—p1)是参与肾小管间质纤维化发病机制的关键性细胞因子13010本研 究在常规西医治疗基础上加用养阴活血方治疗30例CRF患者，观察其对血、尿 TGF-B及肾功能的影响，现报道如下。 1．临床资料 1．1一般资料选择2004年7月至2005年10月苏州大学附属第一医院住院的 CRF患者60例，均符合CRF诊断和分期标准‘3¨。排除已行透析治疗的CRF患者， 纠正引起肾功能损害加重的可逆性因素，如感染、水电解质紊乱、严重心功能衰 竭等，病情稳定后再纳入本研究。60例患者中男26例，女34例；年龄15— 19例，IVIO例；原发病：痛风性肾病4例，慢性肾小球肾炎26例，狼疮性肾炎 12例，糖尿病肾病7例，多囊肾2例，高血压肾小动脉硬化症9例。60例患者采 用随机数字法分为治疗组和对照组，每组各30例。另设同期16例健康人作为正 龄无显著性差异。治疗组和对照组在病程、肾功能分期和原发病方面无显著性差 异，具有可比性。 1．2治疗方法两组均予优质低蛋白饮食、a一酮酸、控制高血压、纠正贫血及 对症处理。治疗组加用养阴活血方，方药主要由黄芪309、熟地159、丹参209、 液200ml行保留灌肠，每日一剂，疗程一月。通过调整大黄的剂量控制大便为每 日2—3次。中药灌肠疗法是在张仲景蜜煎导法的基础上，不断发展和完善起来的 中医外治方法之一，它操作简便，使用安全，适用范围广，无明显不良反应。因 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 第二部分 此，选用此方法治疗，患者容易接受。灌肠操作步骤如下：①输液加温器一套(或 热水袋一只)、250ml无菌盐水瓶1个、一次性导尿管l根、一次性输液器l副、 网袋1只、常规灌肠用物l套；②中药煎成200ml，药温39__4l℃，将药液倒人 无菌盐水瓶内，套好网袋；③按输液法将输液器插入盐水瓶橡皮塞内．排气使灌 肠液流至小橡皮管处，在无菌操作下分离并弃去橡胶管以下部分，与一次性无菌 导尿管硬塑料头端连接；④治疗安排在患者睡前2h进行，并嘱患者排空两便；⑤ 患者取右侧卧位，按常规灌肠操作法进行插管，插入深度为20—25cm，用点滴 法进行灌肠，速度30滴／min，以病人感觉下腹温暖、舒适、无便意为宜。插好 管后，输液器近导尿管处用一次性加温器或热水袋对折，使输液管从中通过f因点 滴速度慢，时间长，原加温的灌肠液会随室温下降)。优点：用加温器(或热水袋) 行输液管外加热，可保持灌肠液恒温；药液点滴法灌肠利于肛管前端肠管边扩张 边送药，防止药液迅速灌人而肠道不能相应扩张，导致药液外溢，影响治疗效果； 肠道插入较传统法深，可减少对直肠壁内的感受器直接受到刺激，引起排便反射 1．3观察指标及检测方法收集受试者24小时尿液，混匀，留取4mL，并于 。冰箱保存备用。血、尿TGF．13采用ELISA法，复孔检测，试剂盒由上海西唐生物 科技有限公司提供。采用美国BIORAD550型酶联免疫检测仪测定。血清肌酐、 尿素氮由美国Beckman公司Cx3全自动生化分析仪检测，根据公式计算内生肌酐 清除率=【(140一年龄)×体质量(kg)×88．4]／72×SCr(umol／L)(女性×o．85)。 1．4疗效判定标准根据1987年第3次全国中医肾病学术会议拟定的标准判 定。显效：①症状明显减轻或消失：(g)Ccr增加≥30％；⑨Scr降低≥30％。以上① 项必备，②、③项具备一项即可。有效：①症状减轻或消失；②ccr增加≥20％； ③Scr降低三20％；④治疗前后以血肌酐的对数或倒数用直线回归方程分析，其斜 率有显著意义者。其中①项必备，其他具备一项即可。无效：不符合显效和有效 条件者。 1．5统计学方法全部数据采用SPSSll．5统计软件进行处理，计量资料用均数 4-标准差表示，两组间的比较用t检验，P0．05有统计学意义。 2．结果 例(13．33％)，总有效率为86．67％；对照妇显效6例(20％)，-fix 8侈fJ(26．67％)，无 活m养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 第二部分 效16例(53．33％)，总有效率为46．67％。两组总有效率及显效率比较均有显著性差 异(PO．01)。 2．2两组治疗前后肾功能变化的比较，见表1。治疗组在治疗后BUN、Scr明 显下降，Ccr升高，提示养阴活血方能够改善CRY患者的肾功能。 表1两组治疗前后BUN、Scr、Ccr的比较(；±j) 注：①与正常对照组比较，P0．01；②与本组治疗前比较，P0．们；③与本组治疗前比较， PO．05；④与对照组治疗后比较，P0．01。 2．3两组治疗前后血、尿TGF-t31水平变化的比较，见表2。治疗后，治疗组 血、尿TGF-131水平显著下降，常规治疗组无明显变化，提示养阴活血方能够减少 。肾脏合成和分泌TGF—B1。在治疗过程中，两组均未出现不良反应。 表2两组治疗前后血、尿TGF．D 1水平变化的比较(；±D 注：①与正常对照组比较，P0．01；②与本组治疗前比较，P0．01。③与对照组治疗后比较 P0．0l。 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进胜的分子生物学机制研究 第二部分 2．4两组治疗前后血、尿TGF-Bl的比较如下图所示 图1治疗组治疗前后血、尿TGF—Bl的比较 图2对照组治疗前后血、尿TGF。B1的比较 6 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进艘的分子生物学机制研究 第二部分 图3治疗组和对照组治疗后血、尿TGF—B1的比较 2．5两组治疗前后BUN，Scr和Ccr的比较如下图所示 图4治疗组治疗前后BUN，Scr和Ccr的比较 17 活m养J；Ij方延缓慢性肾功能衰竭进艘的分了生物学机制研究 第__二部分 图5对照组冶疗前后BUN，Scr和Ccr的比较 图6治疗组和对照组治疗后BUN，Scr和Ccr的比较 3．讨论 TGF-p是一种调节细胞生长和分化的多肽，TGF—B超家族共有25个成员，在哺 乳动物中为TGF—p1．3。人体内几乎所有细胞均可产生TGF—B，在肾脏主要表达 TGF·pl。正常肾组织表达微量的TGF—pl，病理状态下的肾脏产生和分泌TGF—pl 活JnL养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 第二部分 增多。目前认为TGF-Bl是诱发纤维细胞产生胶原、纤维连接蛋白和糖蛋白的最强 因子，且参与肾间质纤维化的各个细节[321。TGF．B最初均是以“潜活前体”形式分 泌的，先储存于细胞外基质(ECM)d0。当氨基端的“潜活相关肽”被切除后成为“活 性TGF．B”而发挥如下作用：①促进成纤维细胞、成骨细胞和雪旺细胞的生长；② 促使细胞外基质(ECM)女H胶原蛋白、纤维黏连蛋白在组织内大量产生，对细胞的形 态发生、增殖和分化过程起着重要作用。其过量生成则与慢性纤维化有关。TGF．6l 可通过至少3个环节引起肾组织内ECM的大量积聚：①刺激肾固有细胞ECM成 分的合成；②抑制多种ECM蛋白降解酶的活力以抑制ECM的降解；③增加ECM 受体表达以促进细胞的黏附1331。在肾间质中成纤维细胞、肾小管上皮细胞和血管 内皮细胞等细胞均能够合成和分泌ECM，其中成纤维细胞是肾间质中产生ECM 的主要细胞1341。ECM在肾组织的过度沉积是引起肾间质纤维化和肾小球硬化的主 要原因。 临床研究表明，肾小管损伤、肾间质炎症细胞浸润是肾小管萎缩、肾间质纤 维化的起始阶段，在这一阶段临床上往往无症状表现。肾小管萎缩、肾间质纤维 化则是肾小管损伤、肾间质炎症细胞浸润的最终作用结果，此阶段在临床上通常 表现为肾功能衰竭。临床上，TIL与肾功能进展密切相关。实验表明，据问质性肾 炎的临床、病理情况发现，间质性’肾炎早期出现肾小管功能不全，其病情严重程 度取决于肾问质炎症本身，而不是肾小球损伤的程度1351。在原发性肾病综合征患 者发现，肾小管萎缩与肾间质纤维化病变越重，血清肌酐异常发生率也越高136J。 在狼疮性肾炎资料中发现，TIL明显者，肾小管功能下降，SCr、尿蛋白水平明显 增高，其生存率及肾存活率则有下降趋势1371。大量临床病理资料表明，各种原因 引起的慢性肾功能损伤与肾小管间质纤维化的严重程度较肾小球病变更为密切， 其主要机制为：①肾间质纤维化使肾小管间质毛细血管狭窄，血管阻力增加，使 肾小球血流量下降；②肾小管尤其是近端肾小管萎缩必然损伤肾小管功能，通过 管球反馈机制影响肾小球滤过功能B钉。损伤的肾小管上皮细胞产生的TGF．6l通过 肾间质成纤维细胞、肾血管及肾问质炎症细胞的作用，在肾间质纤维化中起重要 介导作用。 TGF—Bl被确定为肾脏疾病中肾小球硬化的关键介质。起始肾小球损害引起小 管间质的损害，而小管间质的因素又不可避免地进展，导致肾小球的功能进一步 降低，并造成小管间质的进一步损害，如此循环，最终。肾小球疾病进展致慢性过 活m养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 第二部分 程。在TGF—Bl的作用下，肾小球固有细胞大量合成纤维黏连蛋白，I、III型胶原， 和一些只在损伤时才出现的基质分子。同时，TGF．B1诱导一些整合素受体在肾小 球细胞表面的表达，一旦损伤持续存在，TGF．13l将持续表达，使ECM过度沉积， 导致慢性。肾小球硬化。因此抑制TGF．Bl生成和分泌，阻断其致纤维化作用有助于 延缓CRF的发展。 中医认为CRF为正虚邪实的病征，许多临床研究表明脾肾气阴两虚兼水瘀交 阻是CRF的主要病理机制。肾为水脏，肾气不足，失于蒸腾气化，不能分清泌浊， 以致水湿内聚，因虚致实。邪实又常损伤脾胃，脾虚运化失控，水湿内停，日久 蕴而成浊，留贮体内，病程绵长，湿邪郁久化热，湿热壅塞，耗津伤阴，气机不 畅，血行受阻，脉络不利，积而为瘀。痰血作为原发病的病理产物，又会成为原 发病加剧的继发性病因。既痰阻脉络，又进一步阻滞气机，障碍气化，导致水停 而加重其原发病。故《金匮要略心典》日：“虽病于水，而实出于血也”。可见， CRF的病理演变过程为水病及血而导致血瘀，瘀阻气机、障碍气化，又导致水停， 水瘀相关，互为因果。脏腑虚衰、水湿、血瘀，三者互相影响，形成互为因果的 恶性病理循环，从而水得瘀而愈聚，瘀得水而愈痼，故水瘀交阻，是慢性肾功能 衰竭发生发展的一个重要病机。CRF患者多因先天肾气不足，加之后天失养，故 瘀血水湿等更易在此积聚，类似于肾纤维化的结构；而肾纤维化的本质是肾固有 细胞在病理状态下大量分泌TGF—p1导致ECM在肾小球和肾间质异常堆积。有效 肾单位的丧失使肾功能进行性下降。肾纤维化的主要病理形态特点为’肾间质纤维 化、肾小球硬化。这些都是瘀血在CRF中存在的病理依据。慢性肾功能衰竭临床 以水肿为主要表现。对水肿的治疗，《素问》曾提出“开鬼门，洁净腑，去宛陈荃” 的原则。一般认为系指发汗、利小便、逐水三法。但观《灵枢_，J、针解》有：“宛陈 则除之者，去血脉也”。可知“宛陈”系指体内郁积陈旧之物，不仅指潴留的水湿浊 毒，也包括瘀血之类。故可以认为“去宛陈荃”除攻逐水饮湿浊毒邪外，还应去除痰 血。正如唐容川《血证论》云：“须知痰水之壅皆由瘀血使然，但去瘀血，则“痰水 自消”。《金匮要略》最早提出了“血不利则为水”的病机观点，开创活血利水法治疗 肾病的先河(如治厥而皮水的蒲灰散)。张仲景也选用具有利水活血双重作用的药物 治疗水肿病。如治疗风水之防已黄芪汤和皮水之防已茯苓汤，均以防已为主药， 实取其利水通络之功。通过活血化瘀，可使病变脏腑的瘀滞状态得到改善，恢复 脏腑的气化功能，则有助于水饮湿浊毒邪的排出；况且活血化瘀还可直接改善水 活m养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分了生物学机制研究 第二部分 液的运行和代谢，这样，随着瘀血这一病理因素的消减，就可能使CRF病变过程 中脏腑失调、水湿、血瘀之间的恶性病理循环得到逆转，从而达到延缓CRF病理 进程的目的。活血可以增强血液循环动力，激活组织生机；化瘀可以清除血液循 环的阻力，排除代谢产物。因此活血化瘀对延缓CRF进展具有非常重要的作用。 临床与实验研究证实，活血化瘀药物有改善微循环，消除TGF．Bl和ECM的堆积， 降低血液粘度，降低血脂，改变血液浓、粘、聚倾向的作用。熊佩华教授认为， 瘀血的结果是肾小管上皮细胞和间质血管内皮细胞的损伤，TGF。B1的释放增加， 导致成纤维细胞的增殖，胶原分泌增加，ECM在肾内大量堆积，引起间质纤维化 和肾小球硬化的发生，使肾功能损害进一步恶化。故在治疗上应着重活血化瘀， 同时CRF患者常因湿浊久蕴，热化伤阴或温阳利水药，芳香化湿药及激素的应用 而致伤阴，临床常表现为腰膝酸软、头晕耳鸣、口干咽燥、手足心热、舌红苔黄、 脉细数等肾阴亏虚之症，治疗时应在活血化瘀的基础上兼顾养阴。对于有明显阳 虚症状的病人，应在滋阴壮水的同时，兼顾肾阳，药选兔丝子、仙灵脾、肉从蓉 等温而不燥之品以免伤阴。养阴活血方是熊佩华教授经验方，治疗CRF患者多行 之有效。方中大黄具有活血化瘀，泄浊解毒的作用；黄芪益气健脾，利水消肿， 配当归能补气生血；丹参活血化瘀养血；川芎为“血中之气药”，化瘀滞，通血脉， 为治血瘀之要药；熟地滋肝肾之阴以养血；牡蛎收敛固涩。全方具有扶正祛邪， 滋阴益气，活血化瘀，泄浊利水的功效。 本研究表明，CRF患者血、尿TGF—pI明显高于正常人，经养阴活血方治疗后， 治疗组患者血、尿TGF·p1水平显著下降，肾功能明显改善。提示养阴活血方对肾 功能的保护作用，与抑制肾脏TGF．pl合成和分泌有关。养阴活血方抑制TGF—Bl 的可能机制是：本方中丹参能减轻或消除血小板、白细胞的聚合性所造成的肾毛 细血管床的瘀塞，通过影响某些控制细胞增殖和凋亡的基因表达，抑制肾脏细胞 分泌TGF-B1等致纤维化细胞因子，防止和减少肾间质纤维化和肾小球硬化形成， 延缓CRF的发生””：余凌等通过实验证实了在肾脏慢性纤维化过程中TGF—B。在 受损肾小管上皮细胞高表达，黄芪当归治疗可以有效地降低TGF—BJ表达量，进而 减少细胞外基质聚积“们；大黄中的主要成分为大黄酸，其可逆转TGF—B。诱导的近 端肾小管上皮细胞肥大，抑制TGF．pl刺激ECM合成14110故养阴活血方具有抑制 肾固有细胞产生和分泌TGF—pl的作用，从而减轻了肾间质纤维化，达到延缓肾衰 进展之目的。 活m养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分予生物学机制研究 结论 结论 I、 1．本研究结果表明，各期CRF患者尿TGF。Bl显著高于正常人，在CRF 度密切相关。CRFI期尿TGF．pl明显高于正常组，故尿TGF—pI可作为反映肾功能 呈分离现象，这与Sakui的研究相吻合。此现象可能与肾组织严重纤维化，疤痕形 成反而导致TGF合成和分泌减少有关。综上所述，CRF患者尿TGF—B1的排泄是 增加的，且尿中TGF．B的增加与ECM成分的增加、肾纤维化和肾损害程度相平行。 虽然原发性或继发性肾脏疾病的发病机制不尽相同，但是发展为CRF时，其组织 学的改变都是肾小球硬化、肾间质纤维化和肾小管萎缩。过多表达TGF—B1是其共 同的致病因素。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测尿中TGF．Bl的含量是一种非创 伤性的检测手段，有助于评价CRF的发生发展和肾脏纤维化水平。对CRF的诊断 具有指导意义，在CRF治疗方面，可通过抑制TGF的合成和分泌来延缓CRF的 发展。 2．本研究在常规西医治疗基础上加用养阴活血方治疗30例CRF患者，观察 其对血、尿TGF—B及肾功能的影响。结果显示，与对照组相比较，治疗组显效16 两组总有效率及显效率比较均有显著性差异(P0．01)。本研究表明，CRF患者血、 尿TGF．艮明显高于正常人，经养阴活血方治疗后，治疗组患者血、尿TGF．Bl水 平显著下降，肾功能明显改善。提示养阴活血方对肾功能的保护作用，与抑制肾 脏TGF—Bl合成和分泌，减轻肾间质纤维化有关。 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 综述 综述：结缔组织生长因子与肾间质纤维化的关系 白因子，在介导TGF—B促进组织器官纤维化方面起重要作用。近年来国内外许多 研究证明，CTGF是各种肾脏疾病所致肾纤维化中的一个共同的关键生长因子。阻 断CTGF的表达或抑制其生物学活性可能是更特异，更有效的治疗纤维化的手段。 本文综述了CTGF的基因、结构、功能，在肾小管间质纤维化中的作用及其临床 应用前景。 关键词：结缔组织生长因子转化生长因子一B肾间质 纤维化 以往认为肾功能减退是由于肾小球病变所致。然而，自1970年Schainuch发现 肾小管间质(TI)损害与肾功能减退呈显著相关性而首次提出慢性1rI损害在肾脏 病变的发展过程中起至关重要作用．各种进展型肾脏疾病，无论其原发病如何，将最 终导致肾小管间质纤维化，进展为终末期肾功能衰竭，必须依靠透析维持生命。因此， 积极防治肾小管间质纤维化，对延缓肾功能衰竭的进展及改善各种肾脏疾病的预后 具有重要意义 TGF．Bl是公认的致纤维化的重要因子，具有抗炎症，抗增殖等作用。结缔组织生 长因子(CTGF)作为介导TGF—B促纤维化作用的下游蛋白因子，特异性地调节成 纤维细胞的生长及成纤维细胞外基质的分泌【421。最近研究证实在实验动物与人肾 纤维化中，CTGF的表达与肾小管问质纤维化呈正相关，CTGF介导TGF—B的许多 致纤维化作用。因此，CTGF有可能成为更加特异性的药物作用的靶位点，，成为防 治肾脏纤维化领域新的研究热点之一。 1．CTGF的结构和功能 1．1 early 泌肽和4个功能结构域组成，3’端非编码区含有负性调节元件，可抑制CTGF基因的 转录后表达。CTGF是一种富含半胱氨酸的分泌多肽，相对分子质量为36000～ 38000，由349个氨基酸组成。其氨基端有一个分泌信号肽结构域，其后依次排列着4 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分于生物学机制研究 综述 个功能相关片段：①胰岛素样生长因子(IGF)结合区，属低亲和力IGF结合位点； ②V、ⅣF因子的c型重复区，可能与CTGF的聚集作用以及与其它蛋白质形成复合 物有关；③血小板反应蛋白(TsP)1型重复区，可促进CTGF与可溶性或基质大分 子物质结合，如与葡聚糖结合等；④c末端，富含半胱氨酸，与受体结合有关 1．2 件培养基中，发现了这种新的细胞生长因子-hCTGF[431。此后研究证实，它广泛存 在于多种人类组织器官中，如心、脑、肾、肺、肝、胎盘、胰腺和结缔组织等， 尤其在肾脏中含量最高【删。目前认为，多种组织的成纤维细胞、部分血管内皮和 平滑肌细胞、某些肿瘤细胞和软骨细胞等都可表达CTGF。根据CTGF及其作用的 部位不同，它可显示出不同的生物学效应，但主要表现在以下几个方面：(1)促进 细胞增殖，合成胶原CTGF和TGF．B均可显著增加NPK成纤维细胞中I型胶原、 整合素n5和纤连蛋白基因的转录。CTGF是TGF．B刺激NPK成纤维细胞增殖和 生长过程中必需的介质。抗CTGF的抗体和反义CTGF可分别从蛋白水平和核酸 水平特异性的阻断TGF-p对NPK成纤维细胞的诱导作用。(2)介导细胞黏附体内 CTGF可通过整合素Gtvp3依赖途径刺激内皮细胞的趋化性，介导内皮细胞黏附。 CTGF诱导细胞持久生成更多丝状假足和片状假足，促进细胞伸展，在假足的边缘 伴有整合素a6Bl包含复合体的生成；并激活酪氨酸激酶FAK，使Paxillin磷酸化， 进一步激活Rac，传递细胞黏附信号；还可持续活化P42／P44MAPKs，促进细胞 增殖；持续上调MMP-l和MMP一3基因与蛋白表达，导致基质改变，参与血管形 成中内皮细胞迁移和损伤修复中肉芽组织生成【451。(3)CTGF具有调节血管生成的作 用。在体内或体外实验中，人乳腺癌细胞及纤维肉瘤细胞强烈表达CTGFmRNA， 大量分泌CTGF蛋白，而CTGF特异的多克隆抗体可抑制其血管生成作用；在缺 氧情况下，人乳腺癌细胞CTGF蛋白及mRNA表达增高，其通过旁分泌机制刺激 血管生成作用有利于乳腺癌细胞的入侵，说明肿瘤细胞分泌CTGF是引起血管生 成作用的重要因素。(4)诱导细胞凋亡。最近人们发现细胞凋亡可能参与肾脏炎症 反应的修复过程。急性链球菌感染后肾炎恢复期浸润的炎症细胞可通过细胞凋亡 h 而得到清除。另外，在大鼠抗T Y1．1抗血清肾炎模型中，细胞凋亡亦参与了增 生的系膜细胞的清除。这些结果提示，通过调节细胞的凋亡，特别是某些与纤维 化关系甚为密切的细胞(如成肌纤维细胞)的凋亡，将有可能为肾脏纤维化的防治提 24 活J|lL养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 综述 症患者硬化损害区的成纤维细胞中检测到cTGFmRNA表达，硬化期成纤维细胞 中CTGFmRNA表达较炎症期明显增高，成纤维细胞过度表达CTGF，可促进细胞 的迁徙，增殖及产生基质的作用，促进纤维化的进程f删，提示CTGF与纤维化密 切相关。II型肺泡上皮细胞及激活的成纤维细胞通过自分泌或旁分泌方式产生 CTGF，调节成纤维细胞的增殖和细胞外基质的积聚，在肺纤维化进展中起重要作 用【4”。高糖及高胰岛素是通过上调非酒精性脂肪肝中CTGFmRNA的表达而引起 纤维化的进展1481。以上资料表明，CTGF在不同器官的纤维化进程中起重要作用。 2．CTGF与TGF．8的关系 TGF．B可诱导多种细胞分泌CTFG，反过来CTGF又可作用于相关细胞，参 CTGF反义寡核苷酸探针，可有效抑制TGF．B诱导成纤维细胞增生和胶原合成， CN家族成员 域162—128bp处有一个TGF．B反应元件15”，此元件不存在于其他C 的启动子中，提示TGF．B诱导CTGF表达具有特异性。总之，众多试验结果表明， TGF．B的生物学作用确实与CTGF有关。但前者作用广泛，除能诱导细胞增生和 促进组织纤维化外，尚有抗炎和抗细胞分化等功能；CTGF作用相对单一，因此它 可能仅介导TGF—B的部分生物学效应，主要是在刺激细胞增生和ECM合成，即 促进组织器官纤维化方面起重要作用。 3．肾间质纤维化的发病机理 3．1细胞外基质的作用细胞外基质(ECM)在肾间质的过度沉积是引起间质 纤维化的主要原因，而造成ECM大量沉积的直接原因，则是肾间质中ECM产生 增多和分解减少的结果。在肾间质中成纤维细胞、肾小管上皮细胞和血管内皮细 胞等细胞均能够合成和分泌ECM。细胞凋亡在。肾问质纤维化中也起重要作用，细 胞凋亡在调节机体生长发育、组织器官的增殖和分化中起重要作用。张国强等在 体外培养成纤维细胞发现，来自肾间质纤维化肾脏的成纤维细胞增殖过度、分化 异常及凋亡减少。 3．2细胞因子和生长因子的作用 由于肾小管和肾间质在解剖及功能上的密 切关系，肾小管损伤和肾间质纤维化总是伴同或先后发生。损伤的肾小管上皮细 胞产生的多种细胞因子通过肾间质成纤维细胞、肾血管及肾间质炎症细胞的作用， 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 综述 在肾间质纤维化中起重要介导作用。其中研究较多的是其中研究较多的是转化生 CM 引起ECM的过度积聚：(1)刺激肾小球细胞ECM成分的合成；(2)抑制多种E 蛋白降解酶的活力以抑制ECM的降解；(3)增加ECM受体的表达以促进细胞的粘 附。而TGF—B】的这一作用是通过CTGF完成的[521。在肾脏纤维化过程的早期，可 以观察到肾间质区存在一种表达骨架蛋白——咀．平滑肌肌动蛋白的细胞，称为成肌 纤维细胞，这类细胞是肾间质细胞外基质的主要来源，其数量的多少与间质纤维 化轻重程度密切相关15…。CTGF能诱导成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，在有 TGF．B存在时，成肌纤维细胞的数量增多，细胞外基质合成也增多。促使了肾间 质纤维化。。肾小管间质病变导致肾功能受损的主要机制：间质纤维化使小管间毛 细血管狭窄，血管阻力增加，致肾小球血流量下降；肾小管，特别是近端肾小管 萎缩必然损伤肾小管功能，如肾小球滤过率。已证实除微小病变型外，在所有其 他不同类型肾炎中肾小管间质与GFR间有高度的相关性；肾小管间质病变直接引 起肾小球硬化或纤维化新月体病变。 4．CTGF与肾小管间质纤维化肾间质纤维化是所有慢性肾脏疾病进行性发 展的重要病理基础，它比肾小球硬化更能反映肾脏受损伤的程度。肾间质成纤维 细胞、肾小管上皮细胞及由两者转分化而产生的肌成纤维细胞是肾间质纤维化发 生过程中ECM的主要来源。CTGF除可促进肾小球硬化外，与肾小管间质纤维 化的发生和发展也有十分密切的关系。在体外培养的NRK49F细胞，TGF．B能诱 导其产生纤维粘连蛋白、I型胶原等，而以CTGF反义寡核苷酸转染细胞后，显 著抑制了这些ECM的产生，这说明CTGF是TGF．B介导的肾间质纤维化的重要 下游蛋白因子。CTGF在各种病因的慢性肾炎肾间质纤维化过程中CTGF的表达常 与TGF．B伴随升高。Ito等用原位杂交法研究了包括各种类型的肾脏疾病的65例 人的肾活检标本。对照组肾脏的CTGFmRNA表达主要见于脏层上皮细胞、壁层 上皮细胞及某些间质细胞。CTGF强烈表达不仅见于伴有严重的系膜增生性损害的 毛细血管内增生性肾小球炎、新月体肾小球肾炎、]gA肾病、局灶性节段性肾小球 硬化及糖尿病肾病。而且在慢性肾小管间质损害的部位表达CTGFmRNA的细胞 数增加，以肾小管上皮细胞为主，并与损害的程度相关州54】。利用形态学观察和 增殖细胞核抗原、平滑肌肌动蛋白、免疫组化等方法研究发现CTGFmRNA表达 于再生的上皮细胞及转分化为成肌纤维细胞的上皮细胞，说明CTGF参与调节肾 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分子生物学机制研究 综述 间质成纤维细胞和肾小管上皮细胞的表达自2周起开始上升，4～8周达到高峰， 相互作用可能是造成肾小管间质纤维化的重要原因。同时，结合n平滑肌肌动蛋 白染色，他们发现CTGF是调节肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化的重要因 子。在STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏，肾皮质区CTGFmRNA表达水平显著升高， 尤其是扩张的近曲小管周围更为明显，而且其升高的水平和IGFl的升高有一致性， 这提示CTGF和IGFl的结合和相互作用在糖尿病所致的肾问质损害中发挥了重要 作用。综上所述，CTGF可在TGF．D诱导下，参与间质成纤维细胞或。肾小管上皮 细胞ECM的过量合成，最终导致肾问质纤维化的发生。 虽然大量研究结果提示，TGF一13可诱导CTGF的合成，但仍有少量实验发现 发现，草酸钙能促进肾小管上皮细胞合成CTGF，同时伴有PAll基因表达上调。 因而推测CTGF能以旁分泌形式作用于肾间质成纤维细胞，促使其增生，并通过 促进其产生PAIl来抑制ECM降解，从而导致高草酸钙尿病人肾间质纤维化和肾 功能的进行性损伤。在慢性肾移植排斥反应中，肾间质CTGF表达水平明显升高， 而且CTGF阳性细胞数目和肾小管间质的损害程度呈明显正相关15扪。成肌纤维细 胞可产生CTGF，并可通过自分泌作用参与慢性肾移植排斥反应时肾间质损害的发 生。在慢性高血压肾损伤大鼠模型中，CTGF在受损的肾小球硬化区和肾间质纤维 化区表达均明显升高，而且萎缩的肾小管上皮细胞也有CTGF的表达，CTGF在肾 皮质的表达水平随病程进展而逐渐升高，因此CTGF的过度表达可能是高血压肾 脏硬化进展的重要因素。，由此可见，CTGF可被作为纤维化肾病的治疗靶点。 5．CTGF的临床应用前景 推论阻断CTGF的表达或抑制其生物学活性可能是更特异，更有效的治疗纤 维化的手段。针对CTGF的治疗将更具前景：既可以抑制促肾细胞增殖肥大及ECM 进行性积聚效应，又不影响TGF—B的抗炎症等有益机体的作用。目前，有些学者 尝试通过药物抑制CTGF的表达，从而延缓肾间质纤维化的进展。Hewitson等证 实己可可碱可呈剂量依赖性地降低CTGF的蛋白表达，抑制成纤维细胞的增殖， 从而减轻单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质纤维化的进展和疤痕形成，提示其可能 成为一种新的抗纤维化介质【5…。HMG CoA还原酶抑制剂他汀类药物可干扰人。肾成 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进展的分了生物学机制研究 综述 肾间质细胞表达CTGFmRNA有力的抑制剂，因此在肾纤维化中，CTGF可被他汀 类药物有力的调节。国内黄颂敏等发现血管紧张素II(AngII)能促进培养的正常SD II的促肾间质纤维 Losartan能够部分拮抗AngII对CTGFmRNA的诱导，提示Ang CTGF激活，延缓肾间质纤维化的进展。另外，用CTGF反义寡核苷酸封闭 CTGFmRNA，抑制基因表达，是控制肾间质纤维化的一种崭新手段I删。进一步深 入研究crGr作用的受体和信号传导途径，可能为探索抗纤维化治疗策略提供新 的思路，并在延缓慢性肾脏疾病的进展和降低终末期肾衰的发病率方面起重要作 用。 活血养阴方延缓慢性肾功能衰竭进腱的分子生物学机制研究 参考文献