一种建立miR-32-深圳网站优化推广公司

一种建立miR-32-5p基因敲除小鼠模型的方法及应用与流程

文档序号:16270654发布日期:2018-12-14 22:14阅读:1187来源:国知局
一种建立miR-32-5p基因敲除小鼠模型的方法及应用与流程

本发明属于生物技术领域,具体涉及一种基于crispr/cas9技术的建立mir-32-5p基因敲除小鼠模型的方法及应用。

背景技术

小鼠mir-32-5p基因在4号染色体反链上,全长70bp,是一种非编码单链rna分子。神经系统病变方面:有研究报道,大鼠脊柱神经结扎后,脊髓背角中mir-32-5p表达水平增高。但同时在髓鞘内注射包含anti-mir-32-5p的腺病毒,使mir-32-5p表达水平降低后,由脊柱神经结扎导致的机械触摸痛、热痛觉过敏等神经性疼痛现象得到一定程度的缓解。血管病变方面:我们前期研究表明,在血管平滑肌细胞中,mir-32-5p可以靶向抑制磷酸酶-张力蛋白基因pten的表达,进而激活pi3k-akt通路,使runx2蛋白活化,最终促进血管平滑肌细胞的钙化;mir-32-5p在冠心病合并主动脉钙化的患者血浆中的表达水平明显高于单纯冠心病患者。由此可见,mir-32-5p在神经系统及血管病变进程中扮演着重要角色,建立mir-32-5p基因敲除小鼠模型可为更好地研究相关疾病提供可靠、稳定的动物模型。



技术实现要素:

本发明旨在克服现有技术的问题,利用crispr/cas9基因敲除技术构建一种mir-32-5p基因敲除小鼠动物模型。

为了达到上述目的,本发明提供的技术方案为:

所述建立mir-32-5p基因敲除小鼠模型的方法示意图如图1,具体步骤如下:

(1)确定mir-32-5p基因的特异性靶位点sgrna1、sgrna2和sgrna3;所述mir-32-5p的sgrna1靶序列如seqidno.1所示,sgrna2靶序列如seqidno.2所示,sgrna3靶序列如seqidno.3所示;

其中,seqidno.1:tactaagttgcatgttgtcacgg

seqidno.2:cctcaatgcaatttagtgtgtgt

seqidno.3:gttccctctgcttgctctggtgg;

(2)将c57/bl6雌性小鼠促排卵和体外受精;

(3)将步骤(1)所述的sgrna1、sgrna2和sgrna3与cas9核酸酶mrna体外转录后,显微注射到受精卵中,将受精卵移植到代孕母鼠子宫,繁育得到f0代小鼠,对其进行剪尾,提取dna进行测序;

(4)将f0代阳性小鼠与野生型小鼠交配繁育得到f1代杂合子小鼠;野生型小鼠基因组序列如seqidno.4,测序结果如图2;杂合子小鼠基因组序列如seqidno.5,测序结果如图3;

其中,seqidno.4:

aaaattaatggtcatcaggtatatggtcaatgaaaaatcatgaagttgatttcatataatactttagttaggcatgagtgagattgagagttagttgcatggcatacagaagtgtgtgtcctaaagattgcctctaagctgtggatttcctttgtgattaccgtgtgtgactttgaaattttgaaccttattttaattttaagttcctgttattctaaacggagtgcatttgtcactgagttttcatttcatctcaggattttgaggtagtggcatgcatcctggatccccagcattggcttcccttagagcatgctgtctcctgaatgcacacgtcacacccttctccccgaggttccctctgcttgctctggtggagatattgcacatttagtgtgtgtgatattttcacatgagtgcatgcacacgggtctgggtcttgcttgctgggattagagcttttccatgctggagggctgaactggtgctgagtttcatgtgaggatgaatgctttgtaaggtttgattccgagaatggccatgttctacttcttccccccagttctga

seqidno.5:

tattgtcattcagtatatggtcaatgaaaaatcatgaagttgatttcatataatactttagttaggcatgagtgagattgagagttagttgcatggcatacagaagtgtgtgtcctaaagattgcctctaagctgtggatttcctttgtgattaccgtgtgtgactttgaaattttgaaccttattttaattttaagttcctgttattctaaacggagtgcatttgtcactgagttttcatttcatctcaggattttgaggtagtggcatgcatcctggatccccagcattggcttcccttagagcatgctgtctcctgaatgcacacgtcacacccttctccccgaggttccctctgcttgctctggtggagatattgcacatgtaatgtgtgggatgttatattttcactgcatggcctgcgctctggtccgggtctggtgggatgagatcttatctttgccgtgcggcagagctgaagtggagtttagtgtcatgataagagctatgctttgtttggttcgaataatagacaggtcctgcttcatctcctcatcctgttctga;

(5)将f1代杂合子小鼠杂交获得f2代纯合子小鼠,即为mir-32-5p基因敲除小鼠模型;纯合子小鼠基因组序列如seqidno.6,测序结果如图4;

其中,seqidno.6:

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上述的mir-32-5p基因的特异性靶位点sgrna可应用于建立神经系统以及血管疾病相关的基因敲除小鼠模型;上述的mir-32-5p基因敲除小鼠可用于神经系统以及血管疾病相关研究中。

本发明通过对比观察野生型c57/bl6小鼠与mir-32-5p基因敲除小鼠的行为学现象,发现mir-32-5p基因敲除小鼠具有抗炎性疼痛以及抗抑郁的能力(图5,图6)。

本发明通过以野生型c57/bl6小鼠与mir-32-5p基因敲除小鼠为实验对象,进行皮下注射维生素d3诱导小鼠动脉钙化,发现c57/bl6小鼠主动脉出现钙化,而mir-32-5p基因敲除小鼠的主动脉无明显钙化现象(图7)。

附图说明

图1mir-32-5p基因敲除小鼠构建方案示意图;

图2野生型小鼠基因部分测序结果;

图3杂合子小鼠基因部分测序结果;

图4纯合子小鼠基因部分测序结果;

图5mir-32-5p基因敲除小鼠具有抗炎性疼痛能力;

图6mir-32-5p基因敲除小鼠具有抗抑郁能力;

图7mir-32-5p基因敲除小鼠的抗血管钙化现象。

具体实施方式

实施例1:mir-32-5p基因敲除小鼠的构建方案

(1)构建针对mir-32-5p基因的特异性靶点sgrna1,sgrna2,sgrna3。线性化及纯化dna并在体外转录为mrna。所述mir-32-5p的sgrna1序列如seqidno.1所示;所述mir-32-5p的sgrna2序列如seqidno.2所示;所述mir-32-5p的sgrna3序列如seqidno.3所示;

(2)将步骤(1)所述的纯化sgrna与cas9核酸酶mrna体外转录,注射到受精卵中,取注射后存活的受精卵移植到代孕母鼠子宫,孕育出生的小鼠即为f0代小鼠。

(3)待f0代小鼠出生21天后剪尾提取dna进行pcr鉴定,并测序。得到的f0阳性小鼠mir-32-5p基因有3个碱基的插入(插入序列为tga)和8个碱基的缺失(缺失序列为tgttgtca)。野生型小鼠与f0阳性小鼠的部分基因组序列对比如表1:

表1

(4)把上述步骤(3)得到的f0代阳性小鼠与野生型小鼠交配获得f1代杂合子小鼠。

(5)将f1代杂合子小鼠杂交获得f2代纯合子小鼠,即为mir-32-5p基因敲除小鼠动物模型。

实施例2:mir-32-5p基因敲除小鼠的抗炎性疼痛能力研究

挑选实施例1中得到的8周龄mir-32-5p基因敲除雄性小鼠和野生型c57/bl6小鼠各8只,左侧足底注射10μl完全弗氏佐剂(cfa),分别在0小时、6小时、1天、7天、14天、21天后,使用vonfrey纤维丝测痛仪检测小鼠足底的机械痛阈。机械痛阈值与炎性疼痛程度呈负相关。分析发现,野生型c57/bl6小鼠的机械痛阈值下降,而mir-32-5p基因敲除小鼠的机械痛阈值基本不变(图5)。

实施例3:mir-32-5p基因敲除小鼠的抗抑郁能力研究

小鼠的抑郁行为通过糖水偏好实验以及强迫游泳(forcedswimmingtest,fst)实验来验证。首先是糖水偏好实验:挑选实施例一中得到的8周龄mir-32-5p基因敲除雄性小鼠和野生型c57/bl6小鼠各8只,腹腔注射脂多糖(lps,0.83mg/kg),禁水禁食20小时后,给予1%蔗糖水和清水,测蔗糖水和清水的初质量。给水12小时后将蔗糖水瓶和清水瓶互换位置,24小时后测蔗糖水和清水的剩余质量,计算出蔗糖水消耗量a(g)和清水消耗量b(g),利用公式a/(a+b)*100%,即得到糖水偏好率。糖水偏好率与抑郁程度成负相关关系。分析发现,野生型c57/bl6小鼠的糖水偏好率降低,而mir-32-5p基因敲除小鼠的糖水偏好率基本无变化(图6)。

强迫游泳实验:同样挑选实施例一中得到的8周龄mir-32-5p基因敲除雄性小鼠和野生型c57/bl6小鼠各8只,腹腔注射脂多糖(lps,0.83mg/kg),20小时后,将小鼠放入底部直径10cm、高25cm的塑料透明水桶中(水深10cm),观察小鼠6分钟,前2分钟为适应期,后4分钟记录小鼠的不动时间。强迫游泳的不动时间与抑郁程度成正相关关系。分析发现,mir-32-5p基因敲除小鼠的不动时间少于野生型c57/bl6小鼠(图6)。

实施例4:mir-32-5p基因敲除小鼠的抗血管钙化现象

挑选实施例一中得到的8周龄mir-32-5p基因敲除雄性小鼠和野生型c57/bl6小鼠各5只,以5×105iu/kg/d剂量的维生素d3对小鼠皮下注射,连续注射7天。第8天苯巴比妥麻醉并处死小鼠,取小鼠主动脉组织制作石蜡切片,将石蜡切片分别作he染色、茜素红染色和vonkossa染色(图7)。分析认为,维生素d3皮下注射可诱发野生型c57/bl6小鼠明显的主动脉钙化,而mir-32-5p基因敲除小鼠的钙化程度不明显。

sequencelisting

<110>南华大学附属第一医院

<120>一种建立mir-32-5p基因敲除小鼠模型的方法及应用

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