定点敲除水稻OsAUR2基因的sgRNA的oligo DNA组.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010745748.X (22)申请日 2020.07.29 (71)申请人 江西农业大学 地址 330000 江西省南昌市志敏大道1101 号 (72)发明人 徐杰姜志树贺浩华林小丽 周大虎林小玲刘嘉龙吴慧 朱昌兰边建民贺晓鹏蔡怡聪 孙晓棠 (74)专利代理机构 深圳市鼎浩知识产权代理有 限公司 44544 代理人 张炬杰 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/82(2006.01) C1。

2、2Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) A01H 4/00(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/46(2018.01) (54)发明名称 一种定点敲除水稻OsAUR2基因的sgRNA的 oligo DNA组 (57)摘要 本发明提供一种敲除水稻OsAUR2基因的 sgRNA的oligo DNA组。 针对水稻OsAUR2基因设计 基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列， 将含有编码所述 sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的 载体中， 转化水稻， 实现对水稻OsAUR2基因的敲 除。 其中， sgR。

3、NA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 本发明通过CRISPRCAS9技术对水稻 内源基因OsAUR2进行编辑， 获得了OsAUR2敲除突 变体。 利用本发明制备的sgRNA能高效、 快速、 精 确靶向水稻OsAUR2基因， 在基础研究(水稻有丝 分裂)和生产实践(水稻高产育种和抗逆育种)上 具有一定的意义。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图3页 CN 111793625 A 2020.10.20 CN 111793625 A 1.一种定点敲除水稻OsAUR2基因的sgRNA的oligo DNA组， 其特征在于： 该OsAUR2基因 的sgRNA的DNA序列如SEQ。

4、 ID NO.1所示， 该oligo DNA组为OsAUR2-F1和OsAUR2-R1， OsAUR2- F1核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示， OsAUR2-R1核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 2.如权利要求1所述的定点敲除水稻OsAUR2基因的sgRNA的oligo DNA组在水稻OsAUR2 基因编辑育种中的应用。 3.一种定点敲除水稻OsAUR2基因的sgRNA的载体， 其特征在于， 该载体为VK005- OsAUR2， 该载体通过将oligo DNA组OsAUR2-F1和OsAUR2-R1混合， 通过退火反应形成二聚体 结构， 然后与载体片段VK005进行连接， 构建。

5、得到含有水稻OsAUR2基因靶序列的质粒VK005- OsAUR2， OsAUR2-F1核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示， OsAUR2-R1核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示。 4.一种鉴定OsAUR2基因的sgRNA靶区域编辑情况的引物组， 其特征在于： 该引物组的 DNA序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111793625 A 2 一种定点敲除水稻OsAUR2基因的sgRNA的oligo DNA组 技术领域 0001 发明属于植物基因工程领域。 具体的说， 本发明涉及一种基于CRISPR-CAS9技术定 点敲除水稻O。

6、sAUR2基因的sgRNA的oligo DNA组及应用。 背景技术 0002 Aurora激酶存在于所有真核生物， 在进化上非常保守， 是有丝分裂的关键决定因 子。 Aurora激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员， 酵母中只有一个Aurora激酶,而多细胞真 核生物至少有两个功能不同成员。 Aurora激酶是细胞调节有丝分裂必需的激酶， 特别是染 色体分离过程。 此外， 它们还参与了减数分裂过程。 目前， Aurora激酶在动物细胞中的功能 研究较为清楚， 尤其是人类细胞。 人类细胞中有三个Aurora激酶成员： Aurora A， Aurora B 和Aurora C。 Aurora激酶的缺失。

7、可能导致细胞分裂的失败损害胚胎发育， 而在许多癌症中 Aurora激酶的表达量上调。 越来越多的研究已经证明抑制Aurora激酶可以增强化疗。 在过 去的几十年里， 一系列Aurora激酶抑制剂(AKIs)有效地抑制了许多癌症的发展和生长。 这 表明极光激酶可能是一种新的治疗靶点。 0003 相比之下， 植物中Aurora激酶的功能研究才刚刚开始。 然而， 通过遗传学、 细胞生 物学和生物化学方法已经发现植物中Aurora激酶在形成(不对称)分裂、 染色质修饰和维持 基因组的稳定性发挥重要作用， 但不同Aurora激酶存在一定功能差异性。 拟南芥中有三个 Aurora激酶： AtAUR1、 A。

8、tAUR2和AtAUR3。 AtAUR1和AtAUR2为 -Aurora， 功能类似。 而AtAUR3为 -Aurora， 定位与功能与其它两个成员都有不同。 AtAUR3定位于分生组织细胞间期的细胞 核， 而分裂期定位于着丝粒， 可能在染色体分离发挥作用。 BY2细胞过表达AtAUR3导致异常 的细胞分裂模式， 包括分裂方向异常， 纺锤丝形成存在缺陷等。 0004 有丝分裂是真核生物最重要的生命活动， 而水稻是我国主要的粮食作物， 因此研 究水稻中Aurora激酶的功能对水稻正常发育， 确保产量以及抗逆都具有重要意义。 水稻中 Aurora激酶只有两个成员， -Aurora和 -Aurora。

9、各一个， 分别是OsAUR1和OsAUR2。 目前为 止， 对水稻OsAUR2的功能研究几乎空白， 而OsAUR2对应的突变体也并无发现。 因此， 敲除水 稻中OsAUR2基因获得其突变体对分析其功能以及阐明水稻有丝分裂机制具有重要的作用。 本发明通过设计sgRNA构建基因编辑载体、 转基因技术和CRISPR-CAS9技术获得转基因植 株、 测序分析获得OsAUR2基因编辑(敲除)的植株及序列编辑情况。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种敲除水稻Aurora激酶基因OsAUR2的方法， 提供了一种 基于CRISPR-CAS9技术敲除水稻OsAUR2的sgRNA以及用于敲除水稻OsAU。

10、R2基因的载体。 0006 使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻OsAUR2的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 0007 a)选择OsAUR2基因编码区第36至55核酸序列作为CRISPR/Cas9系统的靶序列(SEQ ID NO.1)： GATCGGCAAGTACATCGGCG； 0008 根据靶序列设计两条oligo DNA： 说明书 1/4 页 3 CN 111793625 A 3 0009 OsAUR2-F1(SEQ ID NO.2)： CAGGATCGGCAAGTACATCGGCG 0010 OsAUR2-R1(SEQ ID NO.3)： AACCGCCGATGTACTTG。

11、CCGATC； 0011 b)将oligo DNA组OsAUR2-F1和OsAUR2-R1混合， 通过退火反应形成二聚体结构， 然 后与载体片段VK005进行连接， 构建得到含有水稻OsAUR2基因靶序列的质粒VK005-OsAUR2； 0012 c)用含有VK005-OsAUR2质粒的根癌农杆菌EHA105侵染水稻的愈伤组织， 通过潮霉 素筛选， 再生获得转基因水稻植株， 并用HPT基因特异引物进行转基因鉴定； 0013 d)利用SQ-OsAUR2-F(SEQ ID NO.4)和SQ-OsAUR2-R(SEQ ID NO.5)对靶序列附近 序列进行扩增， 扩增基因组片段进行测序， 鉴定OsA。

12、UR2编辑情况并筛选敲除植株； 0014 SQ-OsAUR2-F(SEQ ID NO.4)： CCATATCCATTCCACCCAGTGCGGC 0015 SQ-OsAUR2-R(SEQ ID NO.5)： GCTCACAGTAGCAGCGGTGCGCTG 0016 本发明的有益效果是基因编辑载体VK005-OsAUR2转化水稻后， 即可实现高效、 快 速、 特异对水稻OsAUR2基因进行靶向编辑和敲除， 可直接用此做研究材料来探讨OsAUR2基 因的功能和作用机理， 为在生产实践上更好利用OsAUR2基因进行遗传改良奠定基础。 附图说明 0017 图1OsAUR2基因编辑载体VK005-Os。

13、AUR2结构示意图。 0018 图2VK005-OsAUR2转基因鉴定图。 0019 图3转基因阳性植株靶位点附近区域PCR产物。 0020 图4转基因2号株系OsAUR2基因编辑情况。 0021 图5转基因4号株系OsAUR2基因编辑情况。 0022 图6转基因9号株系OsAUR2基因编辑情况。 0023 图7转基因22号株系OsAUR2基因编辑情况。 具体实施方式 0024 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。 这些描述并不是对本发明内容作 进一步的限定， 以下实施例中的若未特别说明， 所用的技术手段为本领域技术人员所熟知 的常规手段。 0025 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 。

14、如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0026 实施例1、 水稻OsAUR2基因sgRNA序列的设计与合成 0027 水稻OsAUR2基因的编码区序列如SEQ ID NO.7所示。 0028 本实施例CRISPR/Cas9编辑靶序列长度为20bp， 位于OsAUR2编码区第一外显子的 第36至55碱基位， 编辑的靶序列为SEQ ID NO.1： GATCGGCAAGTACATCGGCG， 该序列在水稻基 因组上特异， 脱靶概率极低。 0029 根据靶序列合成两条oligo DNA： 0030 OsAUR2-F1(SEQ ID NO.2)： CAGGATCGGCAAGTACATCGGCG 003。

15、1 OsAUR2-R1(SEQ ID NO.3)： AACCGCCGATGTACTTGCCGATC； 0032 实施例2、 OsAUR2编辑载体VK005-OsAUR2构建 0033 将合成的OsAUR2-F1和OsAUR2-R1加水溶解至10 M， 按下列反应体系混合后， 95 加热3分钟， 自然冷却退火使OsAUR2-F1和OsAUR2-R1形成二聚体结构， 然后与VK005载体片 说明书 2/4 页 4 CN 111793625 A 4 段进行连接， 通过热激法将连接产物转化大肠杆菌， 挑选单菌落至LB液体培养基(+kan)培 养12小时， 测序。 挑选测序正确的细菌提取质粒DNA， 获。

16、得含有水稻OsAUR2基因靶序列的编 辑载体VK005-OsAUR2， 载体图见图1。 0034 实施例3、 VK005-OsAUR2载体农杆菌转化 0035 用冻融法将VK005-OsAUR2质粒转化如农杆菌， 将10 l质粒DNA加入200 l农杆菌 EHA105感受态中， 冰浴30min， 液氮冷冻3min， 37水浴5min， 加入1ml YEB培养基， 28摇培 3-4h。 6000rpm， 室温离心1min， 弃上清， 加入200 l YEB培养基重悬菌体， 涂于YEB固体培养 基上(+利福平)， 28培养3天。 挑单菌落鉴定。 0036 实施例4、 水稻转化 0037 本实施选用。

17、日本晴作为受体进行农杆菌转化。 选用300粒左右日本晴种子， 去壳后 用75的乙醇浸泡1分钟， 倒掉75乙醇后用次氯酸钠溶液消毒30分钟， 用无菌水洗6次， 用 灭菌纱布吸干水分后将种子种到含2,4-D(2mg/L)的NB培养基上26避光培养2周， 挑选生 长旺盛的愈伤用作转化的受体。 用含有编辑载体(VK005-OsAUR2)的EHA105菌株制备的工程 菌液侵染水稻愈伤， 在黑暗、 25条件下共培养3天后， 在含有50mg/L Hygromycin的筛选培 养基上光照培养14天左右(光照强度为13200LX， 温度为32)。 将预分化的愈伤转至分化培 养基上在光照条件下(光照强度为1320。

18、0LX， 温度为32)培养一个月左右得到抗性转基因 植株。 用1/2MS培养基生根壮苗获得T0代植株， 移入田间种植。 0038 实施例5、 OsAUR2基因编辑情况分析 0039 取T0代植株叶片提取DNA， 根据潮霉素基因序列设计引物HPT-F和HPT-R， 确定阳性 转基因植株， 见图2。 然后用引物SQ-OsAUR2-F和SQ-OsAUR2-R扩增阳性转基因植株(图3)， 通 过测序分析OsAUR2基因靶位点附近序列(图4-7为部分被编辑植株的测序结果)， 总体结果 统计见表1。 潮霉素基因与靶位点附近序列扩增引物序列为： 0040 SQ-OsAUR2-F(SEQ ID NO.4)： 。

19、CCATATCCATTCCACCCAGTGCGGC 0041 SQ-OsAUR2-R(SEQ ID NO.5)： GCTCACAGTAGCAGCGGTGCGCTG 0042 HPT-F(SEQ ID NO.6)： ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC 0043 HPT-R(SEQ ID NO.7)： TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGA 0044 表1.OsAUR2基因编辑情况分析 说明书 3/4 页 5 CN 111793625 A 5 0045 0046 以上所述仅为本发明较佳的实施例， 并非因此限制本发明的实施方式及保护范 围， 对于本领域技术人员而言， 应当。

20、能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的 等同替换和显而易见的变化所得到的方案， 均应当包含在本发明的保护范围内。 说明书 4/4 页 6 CN 111793625 A 6 序列表 江西农业大学 一种定点敲除水稻OsAUR2基因的sgRNA的oligo DNA组 8 SIPOSequenceListing 1.0 1 20 DNA Oryza sativa 1 gatcggcaag tacatcggcg 20 2 23 DNA 人工序列 2 caggatcggc aagtacatcg gcg 23 3 23 DNA 人工序列 3 aaccgccgat gtacttgccg atc 23 。

21、4 25 DNA 人工序列 4 ccatatccat tccacccagt gcggc 25 5 24 DNA 人工序列 5 gctcacagta gcagcggtgc gctg 24 6 25 DNA 序列表 1/2 页 7 CN 111793625 A 7 人工序列 6 acggtgtcgt ccatcacagt ttgcc 25 7 25 DNA 人工序列 7 ttccggaagt gcttgacatt gggga 25 8 930 DNA Oryza sativa 8 atggagaagc cggagtggag catggacgac ttcgagatcg gcaagtacat cggc。

22、gagggc 60 aagttcggga aggtctacct cgcccgcgag aagcagagcg gctacgtggt ggcgctcaag 120 gtgacattca aggcgaagct ggacaagtac aggttccacg cgcacctgcg gcgggagatc 180 gagatccagc acggcctcga ccaccccaac gtgctccgtc tcttcgcctg gttccacgac 240 gccgagcgcg tcgtcctcgt gctcgagtac gccgcccgtg gggagcttta caagctcctc 300 cgcaccgtcc。

23、 gccgcttctc tgagcgcacc gctgctactt atgttgccag ccttgccggt 360 gcactagcat actgtcataa gaagcaagtt atccatcggg acatcaagcc agagaattta 420 ctccttgata ttgagggccg acttaaaatt gcagattttg gatgggcggt tagatcaaat 480 gctaaacgac acacactttg tggtacaatt gattacctgg cacctgaaat gatagagaaa 540 aaggctcatg accatgctgt tgacaact。

24、gg actttaggaa tcttgtgcta tgagttctta 600 tatgggtcac caccttttga agcagcagaa caggatgata cattgaggag gatagttaaa 660 gtggatttgt cgttcccctc aactccttat gtttctgcag atgctaagga tctcatttgc 720 aaggtaaaat ttgtggtatt gattatacct attgtatatg ttacactaaa atgggttgaa 780 cttttgagtt ttgagcttcg agttcgtatg cagcttttgg tgaaggattc aaacaagaga 840 ctttctcttg atgacataat gaaacatcca tggattgtga agaatgcaga cccatcaggg 900 agttgtagtg accaaaaggc tcgcacataa 930 序列表 2/2 页 8 CN 111793625 A 8 图1 图2 说明书附图 1/3 页 9 CN 111793625 A 9 图3 图4 图5 说明书附图 2/3 页 10 CN 111793625 A 10 图6 图7 说明书附图 3/3 页 11 CN 111793625 A 11 。